[发明专利]基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体、细胞及方法

摘要

本发明公开了一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体、细胞和方法。本发明提供的载体包括阻遏蛋白TetR表达载体和含有操纵基因TetO的双向表达载体，在融合前将两者共转染到供体细胞中。筛选阳性转染的细胞，药物诱导表达山羊TET3，将TET3诱导表达的阳性细胞作为最终供体细胞，再将其注入到去核后的卵母细胞并进行电融合，挑选成功融合的山羊体细胞克隆胚培养。本发明可以有效的降低供体细胞的甲基化水平，纠正克隆胚胎中的异常高甲基化现象，从而显著提高后期山羊体细胞克隆胚胎的发育率和质量，可以高效地体外生产山羊体细胞克隆胚胎，胚胎移植后的克隆山羊的出生率也显著提高。

主权项

1.一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的融合方法，其特征在于：该融合方法包括以下步骤：1)以山羊胎儿成纤维细胞为宿主细胞，将阻遏蛋白表达载体和目的基因诱导表达载体共转染至宿主细胞，所述目的基因诱导表达载体pTRE3G‑GTet3‑EGFP‑BI如说明书附图1C所示，包括目的基因以及通过与阻遏蛋白结合调控目的基因表达的阻遏操纵基因，所述目的基因包括山羊TET3基因和与山羊TET3基因共表达的EGFP基因；所述阻遏蛋白表达载体pEF1a‑Tet3G如说明书附图1A所示，表达四环素阻遏蛋白TetR；所述目的基因诱导表达载体选自含有四环素操纵基因TetO的双向表达载体，且四环素操纵基因TetO对沿两个表达方向排列的目的基因同时进行表达调控，所述目的基因的序列包括位于其中一个表达方向上的EGFP基因读码框和位于另一个表达方向上的山羊TET3基因读码框；所述双向表达载体还包括与EGFP基因及山羊TET3基因分别融合表达的Kozak序列；所述双向表达载体还包括与山羊TET3基因以及对应Kozak序列融合表达的3×FLAG标签序列；所述山羊TET3基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；利用与阻遏蛋白相对应的诱导表达药物对转染成功的宿主细胞进行诱导表达处理，然后将筛选得到的目的基因诱导表达载体的阳性表达细胞作为核移植供体细胞；2)将核移植供体细胞注入到去核后的卵母细胞中后进行电融合，挑选融合细胞进行激活处理，得到克隆胚胎；3)在进行激活处理后于培养液中进行克隆胚培养；所述共转染具体包括以下步骤：将重组载体pTRE3G‑GTet3‑EGFP‑BI和载体pEF1a‑Tet3G通过电击转染按2:1的质量比共转入山羊原代胎儿成纤维细胞；然后使用400～800μg/mL G418对转染后的细胞进行筛选，得到具有G418抗性的细胞克隆；所述重组载体pTRE3G‑GTet3‑EGFP‑BI包括骨架载体pTRE3G‑BI，并且在该载体的双向启动子两侧的多克隆位点分别插入有EGFP基因和山羊TET3基因；所述诱导表达处理具体包括以下步骤：将具有G418抗性的细胞克隆于含有100～200ng/mLDox的培养液中培养，直至得到在荧光显微镜下呈现绿色的细胞克隆，将该细胞克隆扩大培养至细胞密度达到80％后消化并悬浮细胞，然后转接在含有100ng/mL Dox的培养液中，培养72h；所述克隆胚培养具体包括以下步骤：将激活处理后得到的克隆胚胎首先于G1.5培养液中培养24h用于胚胎移植。