[发明专利]一种新型的Y-STR基因座检测用DNA探针合成方法

摘要

本发明公开了一种新型的Y‑STR基因座检测用DNA探针合成方法，本发明采用先合成寡聚核苷酸序列和Linker制备，后氨解纯化，最后进行荧光基团修饰连接的工艺方法，突破的Y‑STR DNA检测试剂盒DNA探针合成关键技术问题，提高DNA探针的荧光强度8‑10倍，从而使Y‑STR DNA检测试剂盒成本更低、荧光均衡性更优、检测灵敏度和准确性更高。

主权项

1.一种新型的Y‑STR基因座检测用DNA探针合成方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)针对Y‑STR基因座DYS481，设计一条28个碱基的寡聚核苷酸序列5`‑TTAATACAACAAAAATTTGGTAATCTG‑3`，然后设计该序列中间需要修饰荧光基团的碱基位；所述序列中间修饰荧光基团的碱基位的设计表如下；(2)寡聚核苷酸序列的合成：合成方法为固相亚磷酰胺三酯法，具体过程为：在固相载体上完成DNA链的合成，合成的方向是由待合成引物的3`端向5`端合成的，相邻的核苷酸通过3`→5`磷酸二酯键连接进行连接，将步骤(1)中设计的寡聚核苷酸序列输入自动化DNA合成仪进行自动合成，其中在对应的修饰碱基位上，通过固相亚磷酸胺法将Amino‑Modifier SerinolPhosphoramidite连接到对该碱基位的单体上，分别合成6条同样的序列的寡聚核苷酸；(3)序列5`端的Special Linker制备：设计5`端C链结构，并通过亚磷酸胺法，重复地连接相应链长的Thiol‑Modifier C6S‑S Phosphoramidite和5’C6‑NH2‑TFA，以得到对应链长的C链，其中C链长度及对应Special Linker合成方案如下；(4)上述合成结束后，对完成合成的寡聚核苷酸进行气相氨解去除保护基团，并进行脱盐纯化回收；(5)经测量回收产物浓度后，分别取每一条寡聚核苷酸的20nmol量进行干燥，干燥后再用pH7.8的缓冲液进行溶解；(6)荧光标记基团原料的溶解：按0.06M的浓度溶解原料，溶剂为无水的CAN；(7)取适量的活化脂原料粉末(按1/3mg每条引物)充分溶解于每条寡聚核苷酸105ul的FAM原料溶液中，并在37℃下振荡混匀，以使FAM荧光基团原料充分活化；(8)之后将上述活化好的荧光原料加入之前溶解好的寡聚核苷酸中，并将反应容器密封，在37℃温度下震荡培养120s，最终将FAM连接到寡聚核苷酸中间碱基和5`末端的‑NH2上，最终合成如下序列结构；(9)反应结束后，进行HPLC纯化回收，并测量浓度；(10)分别取同样量的DNA探针，使用光谱分析仪对每一条DNA探针进行光谱分析。