[发明专利]一种防止烟草外植体褐化的方法

摘要

本发明是一种防止烟草外植体褐化的方法，包括如下步骤：植物种子的消毒、植物种子培养、外植体预培养、外植体组织培养后进行外植体愈伤组织防褐化培养，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30‑50μmol/(m2·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为40天。所述的防褐化培养基为：MS基本培养基中加入防褐添加剂4‑8mg/L柠檬酸，0.2‑0.5g/L聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，30g/L蔗糖，4g/L琼脂，培养基的pH值为5.7，121℃灭菌15min。褐化培养处理后，可以有效缓解褐化现象，改善外植体整体的分化状态。添加柠檬酸和聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)在培养基中，具有使用方便、成本低、效果好等优点。

主权项

1.一种防止烟草外植体褐化的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1：植物种子的消毒;步骤2： 植物种子培养：将步骤1的植物种子接种到MS培养基中，在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/m2·s，光照时间为16小时/天的条件下培养60天，种子发芽长成外植体幼苗；所述MS培养基为MS基本培养基加30g/L蔗糖加4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7；步骤3：外植体预培养：将步骤2得到的外植体幼苗接种于添加有12g鱼腥草且包括有MS基本培养基、4.5g/L琼脂、30g/L蔗糖的MS预培养固体培养基中，控制温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m2·s)，光照时间为11小时/天，培养时间为4天，然后将种子转移并接种于浸泡有10g蜂蜜的MS固体培养基中，控制温度为24℃，光照强度为30-50μmol/(m2·s)，光照时间为10小时/天，培养时间为3天，最后将得到的预培养后的外植体，反复接种于MS培养基4-5次，使组织中的酚类物质部分渗入培养基，所述MS培养基为MS基本培养基加30g/L蔗糖加4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7 ；步骤4：外植体组织培养：将步骤3得到的外植体置于MS分化培养基中，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为7天，得到外植体愈伤组织，所述MS分化培养基为：MS基本培养基+0.5mg/L的萘乙酸NAA+2mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA+30g/L蔗糖+4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7；步骤5：外植体防褐化培养：将步骤 4中得到的外植体愈伤组织置于MS防褐化培养基中，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为40天，使得外植体愈伤组织褐化率降为9.32-35.7％，诱导率91.6-54.6%；所述的MS防褐化培养基为：MS基本培养基中加入防褐添加剂4-8mg/L柠檬酸，0.2-0.5g/L聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，30g/L蔗糖，4g/L琼脂，培养基的pH值为5.7，121℃灭菌15min。