[发明专利]番鸭源鹅细小病毒、鸭2型腺病毒二联灭活疫苗制备方法

摘要

本发明提供了番鸭源鹅细小病毒、鸭2型腺病毒二联灭活疫苗制备方法，该技术方案根据番鸭源鹅细小病毒和鸭2型腺病毒的增殖特点和免疫原性设计了有针对性的工艺条件。具体来看，本发明利用鸡胚增殖番鸭源鹅细小病毒，利用LMH细胞增殖腺病毒，将其灭活后制备成安全有效的番鸭源鹅细小病毒和腺病毒二联灭活疫苗。利用本发明制备的番鸭源鹅细小病毒和腺病毒二联灭活疫苗产生抗体早，保护率高。本发明制备的疫苗一次接种可以预防两病，解决了番鸭因疫苗多次接种而造成的应激反应。

主权项

番鸭源鹅细小病毒、鸭2型腺病毒二联灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)取感染番鸭源鹅细小病毒的、9日龄番鸭，取其肝、脾或肠道组织，研磨后经8000rpm转速离心10min，取上清，即为细小病毒液；2)取感染鸭2型腺病毒的、16日龄番鸭，取其肝或脾组织，研磨后经8000rpm转速离心10min，取上清，即为鸭2型腺病毒液；3)利用0.22μm孔径的滤器过滤步骤1)所得的细小病毒液，10‑2稀释后接种于9～11日龄非免鸡胚，37℃培养，弃去24h非特异死胚，将24h‑120h死胚置于4℃冷藏4‑24h，收获尿囊液，将其在鸡胚上盲传3～5代，直至鸡胚出现致死，并且死亡时间控制在96h内，收获死胚尿囊液；按照同样方法繁毒5～8代，同时测定病毒含量，取病毒效价最高的尿囊液待用；4)利用0.22μm孔径的滤器过滤步骤2)所得的鸭2型腺病毒液，而后将其按细胞液体积的0.1‑2％接种到长至单层状态的LMH细胞中，37℃培养72‑96h，收获病毒，反复冻融3次，盲传3～5代，直至75％细胞出现病变，并且病变时间控制在72h内，收获病毒液；按照同样方法繁毒5～8代，同时测定病毒含量，取病毒效价最高的病毒液待用；5)利用超滤浓缩方法将步骤3)所得产物进行2.5倍体积浓缩，得到细小病毒抗原液；利用超滤浓缩方法将步骤4)所得产物进行2倍体积浓缩，得到鸭2型腺病毒抗原液；6)分别灭活步骤5)所得的细小病毒抗原液和鸭2型腺病毒抗原液；7)将灭活后的细小病毒抗原液和灭活后的鸭2型腺病毒抗原液分别以3500r/min转速离心10min，而后再分别经8层纱布过滤，过滤后等体积混合，再加入混合液体积4％的吐温80，混匀，得到疫苗水相；8)取Marcol52白油，向其中加入1.2％(w/v)的硬脂酸铝，混合后加热，至硬脂酸铝完全溶解后向其中加入白油用量6/94(w/w)的司班80，边加热边搅拌至完全溶解，即得疫苗油相；9)将步骤8)所得的疫苗油相与步骤7)所得的疫苗水相按3:2(w/w)的比例混合，乳化，即得到所述番鸭源鹅细小病毒、鸭2型腺病毒二联灭活疫苗。