[发明专利]毕赤酵母基因敲除和抗性基因回收载体及构建方法与运用

摘要

本发明公开了毕赤酵母基因敲除和抗性基因回收载体及构建方法与运用，属于微生物基因工程领域。本发明毕赤酵母基因敲除的模板载体包括毕赤酵母甲醇型启动子AOX1调控的mazf基因表达盒以及两端的lox71和lox66特异性重组酶识别位点和博来霉素抗性基因表达盒；本发明毕赤酵母基因抗性基因回收载体包括利用毕赤酵母甲醇型启动子AOX1调控的mazf基因表达盒、利用GAP启动子组成型表达的cre基因表达盒和HygB抗性基因表达盒。本发明极大地提高了毕赤酵母基因的敲除效率。本发明提供了基因敲除后抗生素标记回收的方法，为多基因的高效敲除提供了极大的便利，且敲除的效率高，使用的同源臂短。

主权项

1.一种毕赤酵母基因敲除的模板载体pAOXZ-mazf，其特征在于，该模板载体包括毕赤酵母甲醇型启动子AOX1调控的mazf基因表达盒和博来霉素抗性基因表达盒；所述mazf表达盒的5’端含有用于插入待敲除基因下游同源片段的酶切位点A，该酶切位点的5’端含有Cre特异性重组系统识别的lox66位点；所述mazf表达盒的3’端含有用于插入待敲除基因上游同源片段的酶切位点B，该酶切位点的3’端含有Cre特异性重组系统识别的lox71位点；所述博来霉素抗性基因表达盒位于所述lox66位点的5’端与所述lox71位点的3’端之间；所述酶切位点A和酶切位点B为不同的酶切位点，且酶切位点A和酶切位点B在所述模板载体上唯一存在。