[发明专利]一种用于检测胶基型嚼烟对细胞DNA损伤的方法

摘要

本发明涉及一种用于检测胶基型嚼烟对细胞DNA损伤的方法，烟草及烟草制品的安全性生物学评价技术领域。该方法包括样品前处理、单细胞悬浮液制备、细胞浓度计算、细胞接种、受试物暴露、收集细胞、细胞固定、封闭、细胞破膜、细胞染色和流式检测与分析等步骤。本发明综合考察了胶基型嚼烟的使用特点和作用方式，建立了全新的样品前处理方法，选取人口腔角质细胞HOK作为试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本发明方法能够准确有效地检测胶基型嚼烟对细胞DNA损伤的真实影响。

主权项

一种用于检测胶基型嚼烟对细胞DNA损伤的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10mL；之后于37℃下研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10%，得到待测液；步骤（2），单细胞悬液的制备：将人口腔角质细胞HOK于37℃、5%CO₂培养箱中采用口腔角质细胞培养基培养，待细胞汇合率为80～90%时移除培养基，用pH值为7.2的磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1～2min，每25cm²生长面积的细胞需要加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液1～2mL，单层孵育后再加入口腔角质细胞培养基将细胞悬起，得到单细胞悬浮液；步骤（3），单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；步骤（4），细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用口腔角质细胞培养基稀释至2.0×10⁵个/mL，再按接种量为2mL/孔接种到细胞培养板中，之后将细胞培养板置于37℃、5%CO₂培养箱内培养24h；步骤（5），受试物暴露：受试物分为三组：细胞对照组、样品测试组和阳性对照组；移除步骤（4）中细胞培养板内的培养基，再按上述方法进行分组；在细胞对照组和阳性对照组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基，同时，在阳性对照组的孔内加入依托泊苷，使其终浓度为2μM；在样品测试组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基和步骤（1）所得待测液，至待测液的体积百分浓度分别为10%、20%、30%、40%、50%；阳性对照组、细胞对照组和样品测试组的终体积为2mL/孔；之后置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育24h；步骤（6），收集细胞：每孔分别收集细胞，具体的收集方式为：首先收集步骤（6）中的培养液，之后贴壁细胞用1mL 0.25%胰酶消化后连同收集的培养液一起离心，弃上清液，收集细胞；步骤（7），细胞固定：向步骤（6）每孔收集到的细胞中分别加入1ml 预冷至4℃的体积浓度为70%的乙醇，吹打至均匀，4℃固定1h；离心，弃上清，再分别加入500μl预冷至4℃的PBS缓冲液，重悬细胞，再次离心，弃上清，获得细胞；步骤（8），封闭：取每孔经步骤（7）获得的细胞加入含0.2% TritonX‑100（v/v）、10% FBS（v/v）的PBS 200μL，离心，弃上清，获得细胞；步骤（9），细胞破膜：取每孔经步骤（8）获得的细胞，加入含0.2％（v/v）TritonX‑100、0.1%（w/v）BSA的PBS溶液1ml 重悬细胞，处理固定细胞20 min以使细胞膜通透；之后离心，弃上清；再加入5ml PBS重悬细胞，再次离心，获得细胞；步骤（10），细胞染色：取每孔经步骤（9）获得的细胞，加入10μg/ml 异硫氰酸荧光素标记的γH2AX 抗体100μL，避光孵育3 h；之后离心，弃上清；再加入300μL PBS重悬细胞；步骤（11），流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测，获得荧光值；如阳性对照组荧光值大于细胞对照组荧光值1.5倍，则试验有效，反之，则试验无效，需重新按照步骤（1）‑步骤（10）进行试验；在试验有效的情况下，比较样品测试组荧光值和细胞对照组荧光值，如样品测试组荧光值大于细胞对照组荧光值1.5倍，则表明该检测胶基型嚼烟对细胞DNA有损伤，反之，则对细胞DNA无损伤。