[发明专利]一种用于检测胶基型嚼烟对细胞脂质氧化影响的方法

摘要

本发明涉及一种用于检测胶基型嚼烟对细胞脂质氧化影响的方法，属于烟草及烟草制品生物学效应评价技术领域。该方法包括样品前处理、单细胞悬液的制备、单细胞悬浮液的细胞浓度计算、受试物暴露、收集细胞、样品制备、标准品稀释、样品测定和MDA含量计算十大步骤。本发明综合考察胶基型嚼烟细的溶出方式、暴露途径、作用方式，建立了胶基型嚼烟样品前处理方法，样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测胶基型嚼烟对细胞脂质氧化的影响。

主权项

一种用于检测胶基型嚼烟对细胞脂质氧化影响的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10mL；之后于37℃下研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10%，得到待测液；步骤（2），单细胞悬液的制备：将人口腔角质细胞HOK于37℃、5%CO₂培养箱中采用口腔角质细胞培养基培养，待细胞汇合率为80～90%时移除培养基，用pH值为7.2的磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1～2min，每25cm²生长面积的细胞需要加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液1～2mL，单层孵育后再加入口腔角质细胞培养基将细胞悬起，得到单细胞悬浮液；步骤（3），单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；步骤（4），细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用口腔角质细胞培养基稀释至2.0×10⁵个/mL，再按接种量为4mL/皿接种到细胞培养皿中，之后将细胞培养皿置于37℃、5%CO₂培养箱内培养24h；步骤（5），受试物暴露：受试物分为两组：细胞对照组和样品测试组；移除步骤（4）中细胞培养皿内的培养基，再按上述方法进行分组；在细胞对照组相应的皿内加入口腔角质细胞培养基；在样品测试组相应的皿内加入口腔角质细胞培养基和步骤（1）所得待测液，至待测液的体积百分浓度分别为10%、20%、30%、40%、50%；细胞对照组和样品测试组的终体积为6mL/皿；之后置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育24h；步骤（6），收集细胞：每皿分别收集细胞，具体的收集方式为：去除培养基，加入PBS 4mL，浸泡30s后去除PBS，加入1mL 0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用口腔角质细胞培养基悬起，4℃离心，弃上清液，收集细胞；步骤（7），样品制备：将步骤（6）每皿收集得到的细胞，加入100μl细胞裂解液在冰浴环境下对细胞进行裂解，裂解后，4℃离心，取上清液；步骤（8），标准品稀释：取丙二醛的标准品用蒸馏水稀释至1、2、5、10、20、50μM，得到标准品稀释液；步骤（9），样品测定：将步骤（7）每皿得到的上清液和步骤（8）不同浓度梯度的标准品稀释液分别取0.1mL置于不同的离心管中，随后向各离心管中分别加入0.2mL 浓度为0.185mg/ml的硫代巴比妥酸MDA检测工作液混匀，混匀后于100℃沸水中加热15min，之后室温离心，取200μl上清，酶标仪540nm测定吸光度；步骤（10），MDA含量计算：根据标准溶液的浓度及吸光度值绘制标准曲线，然后根据标准曲线及样品测试组吸光度值、细胞对照组的吸光度值，计算样品测试组和细胞对照组的MDA含量；之后，将样品测试组的MDA含量与细胞对照组的MDA含量相比，如有显著差异，且样品测试组的剂量与样品测试组的MDA含量之间有剂量反应关系的，即为阳性结果，该胶基型嚼烟会引起细胞脂质氧化；将样品测试组的MDA含量与细胞对照组的MDA含量相比，如无显著差异，且样品测试组的剂量与样品测试组的MDA含量之间无剂量反应关系的，则为阴性结果，该胶基型嚼烟不会引起细胞脂质氧化。