[发明专利]一种鉴定基因组编辑纯合突变体的方法

摘要

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种简便、快速的筛选、鉴定利用基因组编辑技术创建的纯合突变体的方法。该方法用于筛选与鉴定利用CRISPR/Cas9系统创建的纯合突变体，包括构建CRISPR/Cas9系统载体、转化植物体、利用MSBSP‑PCR筛选纯合突变体等步骤。本申请主要技术思路为：CRISPR/Cas9系统创制的突变体中，相比较于野生型的DNA，PCR反应获得少量的产物或者不能得到产物。另一方面，本申请采用的是两轮PCR，第一轮PCR的产物作为第二轮PCR的模板，可以避免基因组DNA复杂性对产物的影响，提高了PCR方法鉴定CRISPR/Cas9系统创制突变体的效率。

主权项

1.一种鉴定基因组编辑纯合突变体的方法，其特征在于，该方法用于筛选与鉴定利用CRISPR/Cas9系统创建的纯合突变体，具体包括如下步骤：（1）构建CRISPR/Cas9系统载体，根据目的基因序列信息，选取合适的靶点位置PAM，利用CRISPR/Cas9系统构建针对目的基因的特异性载体；（2）将步骤（1）中所构建的CRISPR/Cas9载体转化植物体，筛选获得转基因植株；（3）利用MSBSP‑PCR筛选纯合突变体；筛选时，首先设计PCR用引物，具体而言，根据目的基因选择的靶点分别设计靶点的上、下游引物和靶点特异性引物；MSBSP‑PCR反应时，包括两轮PCR反应，第一轮PCR，对潜在的纯合突变体烟草植株提取DNA，以此为模板，以靶点的上、下游引物进行PCR反应，此为第一轮PCR；第二轮PCR，以第一轮PCR反应的产物为模板，以靶点引物和靶点的下游引物配对，进行第二轮PCR反应；最后，对第二轮PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，同时以野生型作为对照，如果第二轮PCR产物较野生型少，或者第二轮PCR没有产物即为纯合突变体。