[发明专利]一种能够抑制弓形虫增殖的小分子抑制剂的筛选及应用方法

摘要

本发明公开了一种能够抑制弓形虫增殖的小分子抑制剂的筛选方法，其利用Alphascreen实验初步选出11个小分子抑制剂和一个小分子促进剂，这12种药物都是临床用药。在细胞水平上对这12种药物进一步筛选，空斑实验证实GSK J4HCL明显抑制了弓形虫的增殖并通过胞内增殖实验确定了它对弓形虫的EC50值在4.5μM左右。AlphaScreen竞争性抑制实验评估GSK J4HCL抑制TgAtg8‑TgAtg3相互作用的IC50值为11.01μM。利用CCK8实验证明了该药抑制宿主细胞生长的IC50值为34.359μM，远大于该药对虫体的EC50值，说明GSK J4HCL是一个低毒且高效的抗弓形虫药物。

主权项

一种能够抑制弓形虫增殖的小分子抑制剂的筛选方法，步骤如下：(1)纯化HIS‑TgAtg3蛋白选取正确的菌株大量诱导表达，收集菌体，100mL菌液沉淀重悬于10mL PBS缓冲液中，冰浴超声裂解，8000rpm，4℃离心10min收集上清液；1)取上清液10mL样品用0.45μM滤菌器过滤备用；2)混匀质量浓度为50％的NI‑NTA，吸取4mL的质量浓度为50％的NI‑NTA，置于底部有盖子的专用蛋白纯化管中，移去盖子，待完全沉淀，先用10mL灭菌水洗，流速靠重力作用；3)柱子预平衡:用2mL的pH＝7.4的磷酸缓冲液缓冲液(PBS)进行平衡30min，流速靠重力作用；4)将准备好的10mL样品上样，靠重力作用使重组蛋白His‑TgAtg3与镍柱结合；5)用8mL洗脱缓冲液洗柱子，洗脱缓冲液包括pH＝7.4的磷酸缓冲液和500mM的咪唑，并将洗脱缓冲液设置不同梯度备用；6)最后用最高浓度洗脱缓冲液将全部蛋白洗脱，取少量洗脱缓冲液做SDS‑PAGE蛋白电泳检测；7)纯化完毕后用平衡缓冲液平衡柱子，灌满20％量的乙醇，封好加样口，柱子存放4℃备用；8)用透析法将无机盐离子与目的蛋白分离，①透析袋的处理选取截留分子量大小合适的透析袋，并剪成合适的长度，用含0.372g/L EDTA、20g/L NaHCO3的处理液煮沸15min，缓慢冷却后无菌水洗3次，降温备用；②透析将蛋白装入透析袋内，用无菌水作为交换液，将容器置于磁力搅拌器上，4℃搅拌透析过夜；9)BCA法测定蛋白浓度根据待测样品数量，配制适量的BCA工作液，BCA工作液包括BCA试剂A和BCA试剂B，两者的体积比为50：1，充分混匀，将标准蛋白稀释为0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL的浓度梯度，将稀释的标准蛋白加至96孔板中，每孔20μL；待测样品用PBS缓冲液稀释后加至96孔板中，每孔20μL；每孔加入200μLBCA工作液，37℃孵育30min；用酶标仪检测562nm吸光度值，根据标准曲线计算待测样品的蛋白质浓度。(2)纯化GST‑TgAtg8蛋白37℃过夜培养GST‑TgAtg8蛋白后，按照1:100重新接种于新的LB液体培养液中扩大培养，加IPTG诱导剂诱导4小时，收集诱导的菌液沉淀，加入PMSF超声离心后，留取蛋白上清液，0.45μM过滤器过滤后，冰上备用；1)将Glutathione‑Sepharose TM4B介质充分混匀后，取适量加入到放了一片筛板的层析柱中，介质用量根据蛋白产量决定，其最大载量为8mg/mL His标记蛋白介质；2)用5倍柱体积自备去离子水洗柱，共三次；3)用5倍柱体积的新配PBS洗柱，共三次；4)将上述步骤(2)纯化GST‑TgAtg8蛋白中的备用蛋白上清液加入纯化介质，4℃结合1小时；5)用10倍柱体积的新配PBS洗柱，将未结合的杂蛋白洗去，收集并保存穿透液；6)用已配置的洗脱缓进一步冲液洗柱，收集并保存穿透液；7)洗脱后，依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20％乙醇平衡，最后堵住层析柱下端的漏口，4℃保存下次使用；(3)Alphascreen小分子抑制剂筛选实验，生物素标记GST‑TgATG8蛋白后，与HIS‑TgAtg3蛋白及筛选的临床治疗的共1751个小分子药物按照预设的比例共同室温孵育1小时；再将Alphascreen受体磁珠和供体磁珠依次加入蛋白混合物中，在室温中孵育1小时；读板后分析数据；利用Alphascreen筛选出18个小分子抑制剂和一个小分子促进剂；(4)SPR竞争性抑制实验同Alphascreen竞争性抑制实验，纯化GST‑TgAtg8及HIS‑TgAtg3蛋白后，将DMSO溶液以及筛选出的18个小分子抑制剂和1个小分子促进剂分别加入原核表达的TgAtg8‑TgAtg3反应体系中，实时动态监测各小分子药物对TgAtg8‑TgAtg3的阻断作用，利用SPR实验进行反筛查，最终筛选出12个小分子抑制剂和一个小分子促进剂。