[发明专利]一种热处理结合茎尖剥离获得安祖花脱毒苗的培育方法

摘要

本发明公开了一种热处理结合茎尖剥离获得安祖花脱毒苗的培育方法，包括以下步骤：外植体处理；愈伤组织诱导及增殖；不定芽诱导及增殖；不定芽变温热处理；茎尖剥离；茎尖愈伤组织不定芽分化与增殖；病毒检测；脱毒不定芽材料获得；脱毒苗获得。本发明的有益效果为：以本发明方法获得的脱毒苗与直接采用热处理而未进行茎尖剥离的处理方法相比，脱毒率更高，与直接从盆栽植株上获取茎尖外植体进行脱毒苗培育相比，具有一个植株可为茎尖剥离提供上千个外植体的优势，还具有污染率低，成本低，无需损伤取材母株等特点，以此方法进行安祖花脱毒苗培育可在短时间内获得大量脱毒效率高生长健壮的无毒苗，为安祖花脱毒苗的工厂化繁育提供了技术基础。

主权项

1.一种热处理结合茎尖剥离获得安祖花脱毒苗的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：1)外植体的处理：选取带有叶柄，展开一周的安祖花幼嫩叶片，用自来水冲洗、软刷刷净材料表面，罩纱布后流水冲洗30-40分钟，然后将冲洗过的外植体置于超净工作台中，用0.1％HgCl2灭菌5分钟，再用无菌水反复冲洗3-4次，每次2-5分钟；2)愈伤组织的诱导及增殖：将处理好的叶柄用无菌滤纸吸干表面多余水分，切成0.5-1cm的小段，叶片切成大小1cm2的小块，接种至愈伤组织诱导培养基上，黑暗条件23℃-26℃培养60-120天后即可获得愈伤组织，并将获得的愈伤组织接入愈伤组织增殖培养基中继代2-4次；3)不定芽的诱导与增殖：将获得的愈伤组织切成1cm的小块，接种至不定芽诱导培养基中，光照培养30-40天后诱导出1cm小芽，待不定芽长至2cm时即可进行继代增殖；4)不定芽的变温热处理：待不定芽长至2.5-3cm时，将其放入白天16h温度为35℃，夜间8h温度为27℃的人工智能培养箱中，进行变温热处理，培养时间为20-25天；5)茎尖剥离：选取经变温热处理后生长健壮的安祖花组培苗，剥取其顶端带有1-2个叶原基、直径为0.1-0.2mm的茎尖，接种至茎尖分化培养基中进行离体培养，黑暗条件23℃-26℃培养50-70天后即可获得茎尖愈伤组织，将获得的愈伤组织接种到茎尖愈伤组织增殖培养基中继代2-4次；6)茎尖愈伤组织不定芽的分化与增殖：将步骤5)获得的茎尖愈伤组织编好株系后，经过与步骤3)相同的处理后，即可获得大量的不定芽；7)病毒检测：将获得的不同株系的茎尖愈伤组织不定芽，采用RT-PCR法进行病毒检测，每个株系3次重复；8)安祖花脱毒不定芽材料的获得：经步骤7)病毒检测后，将获得的安祖花脱毒株系采用与步骤3)相同的处理，进行不定芽的增殖培养；9)安祖花脱毒苗的获得：将步骤8)脱毒愈伤组织上分化出的组培苗转入壮苗生根培养基，待组培脱毒苗长至4-5cm，即可出瓶种植于温室大棚，获得完整的安祖花脱毒植株。