[发明专利]用于生物纳米探针的SEM/ESEM阴极荧光成像方法

摘要

用于生物纳米探针的SEM/ESEM—阴极荧光成像方法属于阴极荧光成像技术领域，尤其涉及生物荧光成像技术领域，其特征在于，采用SEM/ESEM和CL组成的联机系统，包括量子点和纳米颗粒在内的纳米探针，选择包括玻璃、导电玻璃、SiO2‑Au‑Si复合膜、Si、SiO2、碳基薄膜在内的任何一种衬底，以SEM外接模式、配以阴极荧光谱的CL全光模式，得到CL像和相对应的SE或TE电子像，以及CL像和电子像的合成像，以SEM快速扫描模式、配以阴极荧光谱的CL单光模式，得到单细胞的CL谱，或单一波长的CL单光像和各电子像，从而得到了由纳米颗粒/量子点探针特异性标识的单细胞和单分子的高分辨光子像和对应的电子像，可以在室温～‑180℃下低温成像，还可以与具有不同发光特性的荧光分子/荧光蛋白探针匹配，并减少高能电子束对生物样品的辐照损伤。

主权项

1.用于生物纳米探针的SEM/ESEM阴极荧光成像方法，其特征在于，是在一个用于生物纳米探针的阴极荧光成像系统，以下简称系统中，依次按以下步骤实现的：步骤(1)，构建系统，是一个扫描电子显微镜SEM/环境扫描电镜ESEM和一个阴极荧光谱仪CL组成的联机系统，符号“/”表示“或者”；系统中的扫描电镜SEM/环境扫描电镜ESEM主要包括：电子枪(1)、三级电磁透镜(2)、SEM电子束控制单元、SEM样品室、电子探测器控制单元、样品台控制单元，及SEM主机。系统中的阴极荧光谱仪CL主要包括：CL接收镜(11)、分光光谱仪、图像扫描控制器，及CL主机；所述SEM样品室包括：设在SEM样品室底座(12)上的环形透射电子TE探测器TED(6)、位于所述环形透射电子TE探测器TED(6)上端面上方的TE样品台(5)、底部固定在底座上面、横臂位于所述TE样品台(5)上方的呈“T”字形的SEM样品台(7)、依次叠压在所述SEM样品台(7)横臂上端面的SEM样品托(8)、样品衬底(9)和样品(10)，一个一端悬臂式伸入到所述SEM样品室右侧面上的阴极荧光CL接收镜(11)，一个位于SEM样品台(7)左侧面上的高真空二次电子SE探测器ETD(4)，以及一个低真空二次电子SE探测器LFS(3)；所述样品台控制单元用于通过控制所述SEM样品台(7)和TE样品台(5)的升降和水平移动来调整入射电子束与样品观测点之间的相对位置；所述SEM电子束控制单元用于控制入射电子束在SEM样品(10)表面或TE样品台(5)上的样品上逐点扫描；所述电子探测器控制单元的三个输入端分别与所述高真空二次电子SE探测器ETD(4)、低真空二次电子SE探测器LFS(3)，以及透射电子TE探测器TED(6)的输出端相连；所述SEM主机的一个输入端与所述电子探测器控制单元的输出端相连，而所述SEM主机的另外二个输出端分别与所述SEM电子束控制单元的输入端和SEM显示器的输入端相连；所述分光光谱仪与阴极荧光CL接收镜(11)的输出端相连，接收CL光子信号并在单光模式下进行分光，或在全光模式下让光子通过分光光谱仪而不分光，然后将CL信号输入到CL探测器控制单元；所述CL探测器控制单元，包括一个高灵敏光电倍增管PMT探测器、快速CCD探测器和高灵敏InGaAs红外探测器，分别依次接收和放大分光光谱仪输出的紫外-可见光-红外波段的CL光子，并把光子信号输入到CL谱仪的图像扫描控制器；所述图像扫描控制器在输入CL信号的同时从所述电子探测器控制单元接收包括二次电子SE和透射电子TE在内的电子信号，然后在CL显示器上同时显示全光或单光CL像和对应的电子像，或显示CL谱，并将CL像和对应的电子像合成，形成光子和电子的合成像；步骤(2)，按以下步骤制备样品，所述样品是指：把生物纳米探针或荧光分子探针通过链霉素亲和生物素作用，利用中间分子与细胞上的特定分子偶联，得到特异性标记的单细胞、细胞亚结构及单分子生物样品，以实现在单细胞和单分子水平上的荧光成像，所述纳米探针，至少包括纳米颗粒、量子点、核-壳结构的量子点中的任意一种，所述荧光分子探针至少包括荧光蛋白和荧光染料分子中的任意一种，所述介导探针与特定分子结合的中间分子至少包括核酸适配体分子、抗体分子、多肽分子、小分子化合物中的任何一种，所述标记的特定单分子至少包括细胞蛋白分子、核糖核酸RNA中的任何一种分子；步骤(2.1)，把所述细胞样品(10)孵育固定在一个样品衬底(9)上，所述衬底(9)是玻璃、氧化铟锡ITO导电玻璃、SiO2-Au-Si复合膜，单晶Si、SiO2、碳或石墨烯等碳质薄膜中的任何一种；步骤(2.2)，用上述方法制备的生物纳米探针对固定好的细胞样品进行特异性标定，或用荧光蛋白和荧光染料分子探针中的一种探针对细胞进行转染表达，除去未结合的非特异性探针，得到特异性探针标记后形成的生物探针和探针复合体，包括如下几种：·蛋白质—核酸适配体—生物素—链霉亲和素—纳米探针·蛋白质—核酸适配体—荧光分子探针·蛋白质—抗体—纳米单针/荧光分子探针·蛋白质—抗体—生物素—链霉亲和素—纳米探针和荧光分子探针·特定蛋白质—荧光蛋白，形成融合蛋白·核荧光染料分子步骤(3)，把经过步骤(2)处理的样品(10)放在SEM样品托(8)上固定粘贴，把所述SEM样品托(8)安装在所述SEM样品室的所述SEM样品台(7)上，并使入射电子扫描成像区正对着垂直入射电子束的方向，步骤(4)，把所述分光光谱仪先分别与所述CL探测器控制单元的光电倍增管PMT探测器、快速CCD探测器和InGaAs红外探测器连接后，再分别连接到与所述图像扫描控制器，所述图像扫描控制器与CL主机连接，收集所述SEM样品(10)或TE样品发射出的光子和电子信号，在CL显示器上同时显示CL像和相对应的二次电子SE像或透射电子TE像，以及光子和电子的合成像，或显示CL谱；步骤(5)，对所述扫描电镜SEM样品室抽真空达到设定的真空度，包括达到高真空度﹤10-3Pa或低真空度0.1torr～1torr；步骤(6)，给所述扫描电镜SEM的电子枪(1)施加1kV～30kV的加速电压，10-8A～10-9A的入射电流，调整到5mm～13mm的样品工作距离，×30～×200000的放大倍率，所述入射电子束经过三级电磁透镜(2)聚焦后由所述SEM电子束控制单元控制所述入射电子束在所述SEM样品(10)上逐点扫描，此时，入射电流为10-8A～10-9A，入射束束斑尺寸为No.1～No.7中的任何一种，物镜光阑孔径为100μm、>100μm、100μm、50μm、40μm、30μm、20μm中的任何一种孔径，相应物镜光阑为No.1～No.7中的任何一种，按需要选择物镜光阑；步骤(7)，设定二种工作模式，在全光模式下，收集记录和显示CL全光像，以及相对应的包括高、低真空中的SE像和TE像在内的任何一种，在单光模式下，收集记录和显示某一波长的CL单光像和对应的各电子像，或CL谱，CL谱仪的高灵敏光电倍增管PMT探测器的电压小于1500V，分光光谱仪的衍射光栅为300l/mm或1200l/mm，狭缝宽度范围为1mm～10mm，二种工作模式的步骤如下：若：为了得到所述的CL全光像和对应的各电子像，以及光子-电子合成像，执行步骤(7.1.1)；若：为了得到某一波长的CL单光像和对应的各电子像，或CL谱，执行步骤(7.2.1)；步骤(7.1.1)，把所述扫描电镜SEM的扫描方式设为外接方式，所述分光光谱仪设为全光模式，步骤(7.1.2)，SEM采用所述高真空二次电子SE探测器ETD(4)，在高真空中收集二次电子SE或采用所述低真空二次电子SE探测器LFS(3)，在低真空中收集二次电子SE，或采用所述透射电子TE探测器TED(6)收集透射电子TE；步骤(7.2.1)，把所述扫描电镜SEM的扫描方式设为快速扫描模式，所述分光光谱仪设为单光模式，收集和记录某一波长的CL单光像和对应的所述电子像，或CL谱，并把CL单光像和对应的电子像进行合成；步骤(8)，按以下步骤进行低温成像并收集CL谱，以获得CL像和对应的所述电子像：步骤(8.1)，开启所述阴极荧光谱仪CL的样品制冷装置，设置温度范围室温为～-180℃；步骤(8.2)，重复步骤(6)和(7)，获得二种工作模式下的图像或CL谱。