[发明专利]一种驴精液冷冻保存的方法

摘要

本发明涉及一种驴精液冷冻保存的方法。该方法包括稀释液的配置、鲜精的处理、降温和平衡、冷冻及解冻。本发明中，冷冻液选择了含有一定浓度的氧化石墨烯和甘油组合添加以抑制冰晶形成对精子造成的损伤，而且在精液冷冻前利用–80℃超低温冰箱对精液预先进行20‑40min的冷却处理，简化了在常规精液冷冻过程中必须应用昂贵程序冷冻仪进行精液冷却处理的困难，冷冻后选择60℃的水浴对冷冻精液解冻6秒，有效提高了驴精液冷冻保存后的精子活率，适合于基层单位利用冻精开展驴人工授精的推广应用。

主权项

一种驴精液冷冻保存的方法，其特征在于该方法包括步骤如下：(1)配置稀释液①基础液配置：所述基础液包括按质量份数构成的下述组份：Tris 3.04份、柠檬酸1.70份、葡萄糖1.50份、果糖1.50份、青霉素0.06份，链霉素0.10份、双蒸水100份，将上述组份定容配置成基础液；②稀释Ⅰ液配置：按体积计取基础液85份，取新鲜卵黄液15份，充分混匀，得到稀释Ⅰ液；③稀释Ⅱ液配置：按体积计取上述稀释Ⅰ液80份，取0.5mg/mL氧化石墨烯20份，充分混匀，得到稀释Ⅱ液；④冷冻液配置：按体积计取上述稀释Ⅱ液46份，取甘油4份，充分混匀，得到冷冻液；(2)鲜精的处理①以发情母驴作为台驴，假阴道法采集种公驴精液，采集的精液立即用6‑8层无菌纱布过滤并收集到无菌烧杯中并封口，同时以显微镜检查精子密度和活率，精子活率大于0.70为符合标准的鲜精；②将符合标准的鲜精和稀释Ⅱ液一并放置在35℃恒温培养箱内维持1‑2h，然后，吸取5mL鲜精转移至15mL无菌试管中，2500rpm离心5min，弃上清液，沿管壁缓慢加入5mL稀释Ⅱ液，混合均匀得到稀释鲜精；(3)精液的降温和平衡将上述密封好的稀释鲜精与冷冻稀释液一并放入盛有35℃水的烧杯中，置4℃冰箱降温6‑10h，然后将已冷至4℃的冷冻稀释液吸取5mL缓慢加入降温后的精液中，混合均匀后放回4℃冰箱，平衡2小时，得到平衡后的精液；(4)精液的冷冻及解冻①精液冷冻，将上述平衡后的精液在4℃条件下装入0.25mL的麦管中，置‑80℃超低温冰箱中20‑40min，然后投入液氮冷冻保存；②精液解冻，取冷冻后的精液放入60℃水浴中6秒进行解冻，解冻后，置37℃载物台的显微镜下(400×)观察精子的活率。