[发明专利]测定生物样品中丙酮酸乙酯及其代谢物丙酮酸的方法

摘要

本发明涉及测定生物样品中丙酮酸乙酯及其代谢物丙酮酸的方法，方法使用紫外检测的高效液相色谱法，其可简称为LC‑UV法或者HPLC‑UV法，以生物样品中的丙酮酸含量为检测指标，用从未给予丙酮酸乙酯的生物体获得的生物样品中内源性丙酮酸含量为本底，测定从给予丙酮酸乙酯的生物体获得的生物样品中代谢性丙酮酸含量，进而测定丙酮酸乙酯在生物体内的动力学。本发明建立的HPLC‑UV法，选择性强、操作简单、分析时间快，特别地适用于丙酮酸乙酯药代动力学或者毒代动力学研究中大批量血浆样品的分析。

主权项

1.测定生物样品中丙酮酸乙酯或其代谢产物丙酮酸含量的方法，该方法使用紫外检测的高效液相色谱法，其可简称为LC‑UV法或者HPLC‑UV法，以生物样品中的丙酮酸含量为检测指标，用从未给予丙酮酸乙酯的生物体获得的生物样品中内源性丙酮酸含量为本底，测定从给予丙酮酸乙酯的生物体获得的生物样品中代谢性丙酮酸含量，进而测定丙酮酸乙酯在生物体内的动力学；所述高效液相色谱法包括如下项目或步骤：

(1)色谱分析条件

色谱柱为C18柱，并配合C18保护柱使用；

流动相为0.025～0.075mol/L的KH2PO4缓冲液；

流速为0.8～1.2ml/min，等度洗脱；进样量均为10～50μL；紫外检测波长为205～220nm；

(2)代血浆的配制和测定

精密称取牛血清白蛋白300mg，溶于生理盐水10mL中，涡旋混匀，得到空白代血浆；

取空白代血浆50μL，置于1.5mL离心管中，依次加入超纯水10μL和沉淀剂乙腈150μL，涡旋3min，离心，取上清液10μL进行HPLC‑UV分析测定，以确定空白代血浆中无丙酮酸干扰；

(3)丙酮酸标准溶液的配制和测定

精密称取丙酮酸对照品50.0mg于10mL容量瓶中，用超纯水溶解、定容、摇匀，配制成浓度为5.0mg/mL的储备液，4℃冰箱冷藏保存；精密量取一定体积的储备液，用水稀释成浓度为25、50、100、250、500、1000和2500μg/mL的系列标准溶液；

取空白代血浆50μL，置于1.5mL离心管中，加入丙酮酸系列标准溶液10μL，配制成相当于浓度为5、10、20、50、100、200、500μg/mL的代血浆样品，加入沉淀剂乙腈150μL，涡旋3min，离心，取上清液10μL进行HPLC‑UV分析测定，根据色谱响应值与丙酮酸加样量确定标准曲线；

(4)未给予丙酮酸乙酯生物体的生物样品中丙酮酸含量的测定

取未给予丙酮酸乙酯的生物体生物样品血浆50μL，置于1.5mL离心管中，依次加入超纯水10μL和乙腈沉淀剂150μL，涡旋3min，离心，取上清液10μL进行HPLC‑UV分析测定，根据色谱响应值与标准曲线确定该生物样品中内源性丙酮酸含量，作为丙酮酸的本底含量；

(5)给予丙酮酸乙酯生物体的生物样品中丙酮酸含量的测定

取给予丙酮酸乙酯的生物体生物样品血浆50μL，置于1.5mL离心管中，依次加入超纯水10μL和乙腈沉淀剂150μL，涡旋3min，离心，取上清液10μL进行HPLC‑UV分析测定，根据色谱响应值与标准曲线确定该生物样品中代谢性丙酮酸含量，作为给予丙酮酸乙酯后生物体生物样品中丙酮酸的含量；

(6)根据步骤(4)和步骤(5)的结果确定生物样品中因生物体给予丙酮酸乙酯所贡献的丙酮酸含量，任选的根据生物样品取样时间确定丙酮酸乙酯在生物体内的动力学。

2.根据权利要求1的方法，其中所述的色谱柱是柱长20～30mm、内径4.6mm、填料粒度5μm的色谱柱。

3.根据权利要求1的方法，其中所述的色谱柱是的美国色谱科公司的Discovery品牌的C18柱。

4.根据权利要求1的方法，其中所述的保护柱是美国Phenomenex公司的规格为的4×3.0mmI.D.C18保护柱；随所述量的沉淀剂乙腈一起还添加规定量的盐和醇；和/或，流动相KH2PO4缓冲液中包含0.6～0.8％的H3PO4。

5.根据权利要求1的方法，其中所述生物体选自：人、大鼠、小鼠、犬、猴等。

6.根据权利要求1的方法，其中所述生物样本选自：全血、血浆、尿等。

7.根据权利要求1的方法，其中离心是以12000rpm离心10min。

8.根据权利要求1的方法，其中流速为1ml/min。

9.根据权利要求1的方法，其中进样量为10～20μL；例如，进样量为10μL。

10.根据权利要求1的方法，其中紫外检测波长为210nm。