[发明专利]一种脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法及其培养基

摘要

本发明涉及一种脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法及其专用培养基，包括脐带组织复苏、组织块获得、分离原代干细胞和扩增传代干细胞步骤，其中，使用消化液为含有的Ⅱ型胶原酶、TrypLETM express和脯氨酞氨基酸的氯化钠注射液，使用的培养基为包含硒酸钠、牛转铁蛋白、鸟氨酸、5‑7mg/ml植物血凝素、α‑生育酚琥珀酸单酯、IL‑6、LIF和HGF的DMEM/F12培养基。本发明所提供的分离培养方法，人脐带间充质干细胞爬出时间短，原代干细胞培养周期短，得到的干细胞纯度高，活性好，可进行多次传代，多次传代后得到的干细胞依然具有高度分化的潜能。

主权项

1.一种脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1)脐带组织复苏：取出冻存脐带组织的冻存管，放置于37℃水浴中解冻，解冻完毕后，采用复苏缓冲液洗涤3-5次，得到复苏后脐带组织；2)组织块获得；将步骤1)所得的复苏脐带组织切成1mm3组织块，加入消化液于15℃消化1-2h，然后在37℃消化5-10min,终止消化，移除消化液及悬浮细胞，获取未消化组织块，于氯化钠注射液中漂洗，离心弃上清，得剩余组织块；其中，所述消化液为含有0.5-0.7mg/ml的Ⅱ型胶原酶、0.1-0.2mg/ml的TrypLE express和0.3-0.5mg/ml脯氨酞氨基酸的氯化钠注射液；3)分离原代干细胞：将剩余组织块放置于培养皿中，相邻剩余组织块之间间隔15-20mm，将培养皿放置于37℃培养箱中静置10min,然后向培养皿中加入培养基，保证剩余组织块能完全浸润在培养基中；每天半数换液，培养2天后，将剩余组织块移入新培养皿，更换培养基，然后继续培养至细胞融合80-90％，收获原代干细胞；4)扩增传代干细胞：取步骤3)得到的原代干细胞，重悬于培养基中，按照4-5×104个/mL的浓度，在37.0±0.5℃的温度、5.0±0.2％的CO2浓度和饱和湿度的条件下进行传代培养。