[发明专利]酶解法提取及培养人脐带间充质干细胞的方法

摘要

本发明公开了酶解法提取及培养人脐带间充质干细胞的方法，包括以下步骤：先取脐带组织，然后分离出华通氏胶，接下来将华通氏胶切割成组织匀浆并转入离心管中，按体积比1：1的比例加入预温的0.1％胶原酶I，放入到CO2培养箱中在37℃条件下进行恒温酶解，每隔20min剧烈震荡一次，当组织块已被酶解成糊状时停止酶解，抽取酶解液贴着400目细胞筛进行过滤，向滤液中补加PBS重悬细胞，离心去上清，再用PBS重悬细胞并离心洗涤，最后用细胞培养液将细胞重悬并转移至T75培养瓶中培养。本发明的有益之处在于：采用较低浓度(0.1％)的胶原酶I进行酶解，不仅减小了对细胞的损伤，同时降低了提取及培养的成本。 1

主权项

1.酶解法提取及培养人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

Step1：取健康产妇39周～40周正常分娩或剖腹产脐带组织；

Step2：从脐带组织中分离出华通氏胶；

Step3：将华通氏胶置于培养皿中，切割成组织匀浆，然后转入离心管中，按体积比1：1的比例加入预温的0.1％胶原酶I，放入到CO₂培养箱中在37℃条件下进行恒温酶解，每隔20min剧烈震荡一次，酶解2h左右观察酶解效果，当组织块已被酶解成糊状时停止酶解，用注射器抽取酶解液贴着400目细胞筛进行过滤，向滤液中补加PBS重悬细胞，300G离心5min，去掉上清，再次用PBS重悬细胞并离心洗涤，最后用细胞培养液将细胞重悬并转移至T75培养瓶中；

Step4：将装有UCMSC的T75培养瓶放置于CO₂培养箱中，在37℃条件下恒温培养，每天观察UCMSC的生长情况，当细胞融合度达到80％时，执行P0～P1传代操作；

Step5：用移液器移去T75培养瓶内的细胞培养液，用PBS洗两遍，然后向T75培养瓶中加入4倍稀释的Accutase酶液2ml，消化1min～2min，1000rpm×5min收集细胞，弃去上清液，收集的细胞用D‑PBS 1000rpm×5min洗涤一次，弃去上清液，用传代培养液重悬，传代。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在Step1中，所述脐带组织的保存方法为：

在手术室洁净条件下，将脐带组织放入预先加注有100ml组织保护液的T75培养瓶中，密封，2℃～8℃条件下保存。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述组织保护液的成分为：

肝素2500IU、庆大霉素16000IU、0.9％生理盐水100ml。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在Step3、Step4和Step5中，所用到的细胞培养液的成分为：

α‑MEM液体培养基475ml、UltraGRO细胞营养添加物25ml、肝素钠1000IU、硫酸庆大霉素40000IU。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在Step4中，在培养的过程中：

培养的前2d，静置，不要摇动T75培养瓶，让单细胞充分贴壁；

培养的第3d开始，每2d进行一次半量换液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在Step5中，传代密度为10000个细胞/cm²～15000个细胞/cm²。