[发明专利]一种抗肿瘤试剂在人白血病细胞中的应用

摘要

本发明提供了一种抗肿瘤试剂在人白血病细胞中的应用，具体为细胞分裂素ortho‐Topolin Riboside作为一种去抗肿瘤药物对人白血病细胞株的抗肿瘤作用，实验采用不同浓度oTR及现有的三种临床药物处理白血病细胞株THP‐1，对比发现oTR的抗肿瘤效果可达到临床药物的水平。此研究属于生物化学与分子生物学技术领域。本发明的数据建立在oTR对人的9大瘤系60种肿瘤细胞系具有非常显著的体外增殖抑制活性，且效果强于临床药物，其中对白血病细胞株的药物敏感性较强的基础之上。

主权项

一种抗肿瘤试剂在人白血病细胞中的应用，其特征在于，步骤如下：(1)细胞培养：将人白血病细胞株THP‐1悬浮于含有灭活胎牛血清的无菌RPMI 1640培养液中，使用25cm2培养瓶培养，置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中培养；THP‐1细胞为悬浮细胞，48h后离心传代，在转速1000rpm，离心5min条件下分离细胞，弃上清，使用新鲜含有灭活胎牛血清的无菌RPMI 1640培养液重悬细胞，传代于同规格培养瓶中；(2)药物配制：药物oTR、DCA和Flu均用0.1％DMSO溶解，继续用无菌RPMI 1640培养基将溶解好的药物稀释至浓度为0.01μM～50μM；Ara‐C用无菌RPMI 1640培养基直接溶解至浓度为0.01μM～50μM，过滤除菌，室温保存；(3)检测细胞增殖抑制率：将处于对数生长期的5×103～1×104个THP‐1细胞接种于每孔含有100μl RPMI 1640培养液的96孔板中，设置18组实验，每组3个复孔，第1组：空白对照组；第2组：0.1％DMSO组；第3组：0.01μM oTR组；第4组：0.1μM oTR组；第5组：1μM oTR组；第6组：10μM oTR组；第7组：0.01μM Ara‐C组；第8组：0.1μM Ara‐C组；第9组：1μM Ara‐C组；第10组：10μM Ara‐C组；第11组：0.01μM DCA组；第12组：0.1μM DCA组；第13组：1μM DCA组；第14组：10μM DCA组；第15组：0.01μM Flu组；第16组：0.1μM Flu组；第17组：1μM Flu组；第18组：10μM Flu组；分别向各组中加入对应的药物，置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育1～3天，利用CCK‐8法检测各组细胞增殖抑制率，每孔加入10μL CCK‐8溶液，孵育2.5h后，在450nm吸收波长处检测各组细胞吸光度A值，按照公式计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率＝(对照组A值－实验组A值)/对照组A值×100％，记录数据；(4)细胞亚倍体峰检测凋亡：同样将处于对数生长期的THP‐1细胞分别用药物oTR、Ara‐C、DCA及Flu处理，取1×105～3×105个THP‐1细胞接种于每孔含有3ml RPMI 1640培养液的6孔板中，设置9组实验，第1组：空白对照组；第2组：0.1μM oTR组；第3组：1μM oTR组；第4组：0.1μM Ara‐C组；第5组：1μM Ara‐C组；第6组：0.1μM DCA组；第7组：1μM DCA组；第8组：0.1μM Flu组；第9组：1μM Flu组；分别加入各组对应的药物，置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育1～3天，收集细胞；按照Annexin V‐FITC凋亡检测试剂盒说明书配制染色缓冲液，用蒸馏水将4×Binding Buffer稀释成1×Binding Buffer供后续使用；用流式管收集对照组和实验组细胞成九个样品，用PBS充分洗涤后，每组取总数为2×105～5×105个细胞；用195μL稀释得到的染色缓冲液重悬各组细胞，再分别加入5μL Annexin V‐FITC混匀，室温避光孵育10～15min，洗涤一次细胞后再用200μL稀释得到的染色缓冲液重悬，加入10μL Propidium Iodide，混匀，4h内上流式细胞仪检测分析，重复3次，计算细胞凋亡率。