[发明专利]以七鳃鳗李蛋白为标志物的肿瘤检测试剂盒

摘要

本发明公开一种以七鳃鳗李蛋白为标志物的肿瘤检测试剂盒，有捕获试剂及检测试剂，所述捕获试剂及检测试剂均为可特异性标记肿瘤细胞表面脂笩上的糖和鞘磷脂的七鳃鳗重组李蛋白。因所制得的重组李蛋白rLi protein具有比抗体分子更高的稳定性、特异性和亲合力，其溶解状态4℃放置一年以上，仍然保持完整的抗原结合能力，对肿瘤细胞抗原的识别更加灵敏。本发明具有检测灵敏度高、储存与运输方便、有效期长且生产成本低廉等优点。 1

主权项

1.一种以七鳃鳗李蛋白为标志物的肿瘤检测试剂盒，有捕获试剂及检测试剂，其特征在于：所述捕获试剂及检测试剂均为可特异性标记肿瘤细胞表面脂笩上的糖和鞘磷脂的七鳃鳗重组李蛋白。

2. 根据权利要求1所述以七鳃鳗李蛋白为标志物的肿瘤检测试剂盒，其特征在于所述可特异性标记肿瘤细胞表面脂笩上的糖和鞘磷脂的七鳃鳗重组李蛋白按如下方法制备：

（1）七鳃鳗重组李蛋白rLi protein的诱导表达

①以1μL pColdⅠ‑rLi protein质粒DNA转化BL21(DE3)感受态细胞，涂布平板；

②挑选阳性克隆，接种至10 mL含有Amp＋的LB培养基中37℃、120 rpm震荡培养过夜；

③次日按上述培养菌液/含有Amp＋的LB培养基以体积比1:100比例接种，37℃、180 rpm震荡培养；

④至培养基中菌生长达到对数生长期，即OD600 为0.4 ~ 0.6时，加入终浓度为0.7 mmol/L的IPTG，15℃、100 rpm 诱导24 h；

⑤菌液7000 rpm离心4℃、15 min，收集上清，得到重组蛋白rLi protein；

（2）重组蛋白rLi protein的纯化

①将收集的上清液用0.45 μm滤膜过滤，用于蛋白纯化；

②配制纯化溶液，配方如下：

溶液配方Binding Buffer15 mM咪唑、20 mM Tris‑HCl、150 mM   NaCl，pH 8.0Washing Buffer 130 mM咪唑、20 mM Tris‑HCl、150 mM   NaCl，pH 8.0Washing Buffer 250 mM咪唑、20 mM Tris‑HCl、150 mM   NaCl，pH 8.0Washing Buffer3 70 mM咪唑、20 mM Tris‑HCl、150 mM   NaCl，pH 8.0Eluting Buffer350 mM咪唑、20 mM Tris‑HCl、150 mM   NaCl，pH 8.0Dialysis Soution20 mM Tris‑HCl，pH 8.0

③安装层析柱调节液体流速为2 mL/min，用10倍柱床体积的1×Binding Buffer对柱子进行平衡；

④调节液体流速为0.5 mL/min，将过滤好的上清液上样；

⑤调节液体流速为1 mL/min，用10倍柱床体积的Binding Buffer洗柱；

⑥依次用10倍柱体积的Washing Buffer 1，Washing Buffer 2，Washing Buffer 3洗柱；

⑦用5倍柱床体积的Eluting Buffer洗脱；

⑧将Eluting Buffer洗脱得到的目的蛋白，置于20倍体积的Dialysis Soution透析液中透析除盐；

⑨透析12 h后，得到纯化重组蛋白rLi protein；

（3）纯化重组蛋白rLi protein的Alexa flour 488荧光标记。