[发明专利]具有表面蛋白简化糖基化的病毒颗粒的生产方法

摘要

提供了生产在结构或表面蛋白上具有简化糖基化的病毒颗粒的方法。在用作疫苗生产靶标时，此类位点的保守性质产生出对病毒突变敏感性降低的疫苗。公开了糖基化抑制剂用于生产具有简化糖基化谱的病毒的用途。提供了流感病毒和用于生产单糖基化流感病毒颗粒的方法的示例性公开。提供了A型流感病毒NIBRG‑14(H5N1)的单糖基化形式的生产方法。 1

主权项

1.一种用于生产单糖基化流感病毒的方法，所述方法包括：

a)在具有有效量甘露糖苷酶抑制剂的适合宿主中培养含有血凝素HA抗原的流感病毒，其中所述甘露糖苷酶抑制剂的浓度足以抑制N‑糖基化途径中的α‑甘露糖苷酶I，其中适合宿主是无特异病原的(SPF)含胚鸡蛋；

b)回收步骤a)中生产的流感病毒；

c)将步骤b)中回收的流感病毒接触内切糖苷酶Endo H，以生产具有单糖基化HA抗原的流感病毒，其中Endo H的浓度足以除去高甘露糖型聚糖；和

d)分离所述的具有单糖基化HA抗原的流感病毒。

2.根据权利要求1的方法，其中所述HA抗原源自高致病性H5N1流感病毒。

3.根据权利要求2的方法，其中所述高致病性H5N1流感病毒是NIBRG‑14。

4.根据权利要求1的方法，其中所述甘露糖苷酶抑制剂是基夫碱Kif。

5.根据权利要求1的方法，其中所述甘露糖苷酶抑制剂是脱氧甘露糖野尻霉素(DMJ)。

6.根据权利要求1的方法，其中α‑甘露糖苷酶I的抑制产生带有Man₉(GlcNAc)₂的糖蛋白。

7.根据权利要求4的方法，其中向无特异病原的(SPF)含胚鸡蛋的尿囊腔中添加基夫碱。

8.根据权利要求7的方法，其中以0.005至0.5mg/ml的浓度添加基夫碱。

9.根据权利要求1的方法，其中通过孵育足以生长所述流感病毒的时间来进行步骤b)；然后分离包含所述流感病毒的SPF含胚鸡蛋的尿囊液。

10.根据权利要求9的方法，其中在步骤c)中，Endo H的浓度为0.1至100μg/mL。

11.根据权利要求9的方法，其中通过包括密度梯度超速离心的方法进行步骤d)。

12.根据权利要求1的方法，其还包括通过包括超滤的方法纯化具有所述单糖基化流感病毒HA抗原的流感病毒。

13.根据权利要求12的方法，其中所述超滤包括使用0.2μm滤器。

14.根据权利要求1的方法，其还包括通过电子显微镜分析具有所述单糖基化流感病毒HA抗原的流感病毒。

15.根据权利要求1的方法，其还包括通过包括PNGase处理的方法量化具有所述单糖基化流感病毒HA抗原的流感病毒。

16.根据权利要求1的方法，其还包括通过包括SDS‑PAGE电层析的方法量化具有所述单糖基化流感病毒HA抗原的流感病毒。

17.根据权利要求1的方法，其还包括通过包括质谱的方法分析具有所述单糖基化流感病毒HA抗原的流感病毒的聚糖组成。

18.根据权利要求1的方法，其中所述流感病毒HA抗原选自单糖基化流感病毒HI、H3和H5组成的组。

19.一种用于生产单糖基化流感病毒的方法，所述方法包括：

a)在具有有效量甘露糖苷酶抑制剂的适合宿主中培养含有血凝素(HA)抗原的流感病毒，其中所述甘露糖苷酶抑制剂的浓度足以抑制N‑糖基化途径中的α‑甘露糖苷酶I，其中适合宿主是无特异病原的(SPF)含胚鸡蛋；

b)回收步骤a)中生产的流感病毒；

c)将步骤b)中回收的流感病毒接触内切糖苷酶(Endo H)，以生产具有单糖基化HA抗原的流感病毒，其中Endo H的浓度足以除去高甘露糖型聚糖；和

d)分离所述的具有单糖基化HA抗原的流感病毒；

并且，其中步骤(d)中所述的流感病毒具有以下特征：

除了在残基295有～10％的Man₆(GlcNAc)₂和残基489有～10％Man_7‑9(GlcNAc)₂的高‑甘露糖型聚糖之外，所有其他聚糖都是具有所连接的单个GlcNAc糖残基的单糖基化的。

20.根据权利要求1的方法，其中步骤(d)具有单糖基化HA抗原的流感病毒具有以下特征：除了在残基295有～10％的Man₆(GlcNAc)₂和残基489有～10％Man_7‑9(GlcNAc)₂的高‑甘露糖型聚糖之外，所有其他聚糖都是具有所连接的单个GlcNAc糖残基的单糖基化的。

21.一种单糖基化HA抗原的流感病毒，其特征在于，所述的流感病毒除了在残基295有～10％的Man₆(GlcNAc)₂和残基489有～10％Man_7‑9(GlcNAc)₂的高‑甘露糖型聚糖之外，所有其他聚糖都是具有所连接的单个GlcNAc糖残基的单糖基化的。

22.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包含至少一个部分糖基化的HA糖蛋白和药学可接受的载体，所述部分糖基化的HA糖蛋白选自部分糖基化的流感病毒HI、H3和H5组成的组；

较佳地，所述部分糖基化的HA糖蛋白位于完整流感病毒上。

23.如权利要求22所述的疫苗，其特征在于，所述的部分糖基化的HA糖蛋白为单糖基化HA抗原。