[发明专利]适于蛋白质组差异定量分析的三七根茎总蛋白的提取方法

摘要

本发明公开了一种适于蛋白质组差异定量分析的三七根茎总蛋白的提取方法，包括：步骤一、于温度4℃下，取三七材料粉末，加入不含酚类的蛋白质裂解液，超声，离心得到上清液；步骤二、2.1)将上清液与第一抽提液混匀，‑20℃静置1小时，离心，取下层沉淀，得到第一沉淀；2.2)将第一沉淀与第二抽提液混匀，然后于4℃、12000r/min转速条件下离心30min，取下层沉淀，得到第二沉淀；2.3)将第二沉淀干燥，之后溶于iTRAQ标记液中，再次离心取上清液，该上清液即为适于蛋白质组差异定量分析的三七根茎总蛋白。本发明工艺简单，蛋白得率高、纯度高，可应用于三七根茎蛋白质组差异定量分析。 1

主权项

1.一种适于蛋白质组差异定量分析的三七根茎总蛋白的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、于温度4℃下，取三七材料粉末，加入不含酚类的蛋白质裂解液，于超声功率150～210W下超声8～12分钟，其中，每超声1～3s，停2～4s，离心得到上清液；

步骤二、2.1)将步骤一中得到的上清液与第一抽提液混匀，‑20℃静置1小时，之后于4℃、12000r/min转速条件下离心30min，取下层沉淀，得到第一沉淀；

2.2)将所述第一沉淀与第二抽提液混匀，然后于4℃、12000r/min转速条件下离心30min，取下层沉淀，得到第二沉淀；

2.3)将所述第二沉淀真空干燥1h或者于真空浓缩仪中干燥20～30min，之后将所述第二沉淀溶于iTRAQ标记液中，再次离心取上清液，该上清液即为适于蛋白质组差异定量分析的三七根茎总蛋白；

其中，所述蛋白质裂解液包含：0.02～0.08M三羟甲基氨基甲烷，1.2～1.8M氯化钠，0.001M苯甲基磺酰氟，0.001M乙二胺四乙酸二钠，0.08～0.12％(w/v)乙基苯基聚乙二醇，0.08～0.12％(w/v)脱氧胆酸钠，0.08～0.12％(w/v)十二烷基硫酸钠和0.0001M亮肽素。

2.如权利要求1所述的适于蛋白质组差异定量分析的三七根茎总蛋白的提取方法，其特征在于，所述步骤一中，所述三七材料粉末与所述蛋白质裂解液的质量体积比为1:1～2。

3.如权利要求1所述的适于蛋白质组差异定量分析的三七根茎总蛋白的提取方法，其特征在于，所述蛋白质裂解液包含：0.05M三羟甲基氨基甲烷，1.5M氯化钠，0.001M苯甲基磺酰氟，0.001M乙二胺四乙酸二钠，0.1％(w/v)乙基苯基聚乙二醇，0.1％(w/v)脱氧胆酸钠和0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠和0.0001M亮肽素。

4.如权利要求1所述的适于蛋白质组差异定量分析的三七根茎总蛋白的提取方法，其特征在于，所述第一抽提液包含：预冷的丙酮、三氯乙酸和β‑巯基乙醇，其加入量分别为每1g上清液中添加8～10ml预冷的丙酮、1ml三氯乙酸和和10μLβ‑巯基乙醇，且将预冷的丙酮、三氯乙酸和β‑巯基乙醇依次加入上清液中。

5.如权利要求1所述的适于蛋白质组差异定量分析的三七根茎总蛋白的提取方法，其特征在于，所述第二抽提液包含：丙酮，其加入量为每1g第一沉淀添加1ml预冷的丙酮。

6.如权利要求1所述的适于蛋白质组差异定量分析的三七根茎总蛋白的提取方法，其特征在于，所述步骤一中，所述离心的具体条件为4℃、12000r/min转速条件下离心30min。

7.如权利要求1所述的适于蛋白质组差异定量分析的三七根茎总蛋白的提取方法，其特征在于，所述步骤一中，所述三七材料粉末来源于三七根组织或茎组织。

8.如权利要求1所述的适于蛋白质组差异定量分析的三七根茎总蛋白的提取方法，其特征在于，在步骤2.2)和2.3)之间还包括如下步骤：

将所述第二沉淀加入95％的乙醇中，乙醇与所述第二沉淀的质量比为1：1，之后离心，然后于温度0～4℃下抽吸乙醇和第二沉淀的混合物，抽吸的真空度为80～90KPa下抽吸4～5小时；

之后再进入步骤2.3)。

9.如权利要求1所述的适于蛋白质组差异定量分析的三七根茎总蛋白的提取方法，其特征在于，获得到所述三七材料粉末的方法包括如下步骤：

采集三七植株，清水洗净粘附的泥土后用滤纸吸干水分，分离根和茎组织，并切成0.1～0.5cm的块状，用锡箔纸包装成小袋分装，迅速冻存于液氮中；

之后将三七根或茎放入冰浴的研钵中，一遍加液氮一边研磨得到粉末，得到所述三七材料粉末，其中，保持所述三七材料粉末的温度在0℃以下，研磨时转速为10～20rpm。