[发明专利]一种优化的生物膜活菌计数法

摘要

本发明涉及口腔护理产品抗菌功效评价技术领域，具体为一种优化的生物膜活菌计数法。本发明提供的优化的生物膜活菌计数法，先通过胰酶溶液对牙菌斑生物膜模型进行消化分散，同时再对形成生物膜菌悬液进行超声分散，然后采用活菌计数法计算细菌数目，细菌团分散效果明显，可提高活菌计数结果，更加接近真实的生物膜上活体细菌的数目。此外，通过优化牙菌斑生物膜模型的培养条件，在特定的培养条件下培养形成可靠的且可提高对口腔护理产品抗菌功效评价准确度的牙菌斑生物膜模型，尤其是通过加入一定含量的碳酸钙悬浊液作为附着力促进剂，可保证本发明的计数方法对后续口腔护理产品评价准确度的情况下有效缩短牙菌斑生物膜模型的培养时间。

主权项

1.一种优化的生物膜活菌计数法，其特征在于，包括以下步骤：

S1消化分散：向生物膜中加入胰酶溶液并在常温下进行消化处理，然后再向生物膜中加入培养基，接着将生物膜吹打混匀重悬形成生物膜菌悬液；

S12超声分散：将步骤S1所得的生物膜菌悬液装入无菌离心管中，然后将装有生物膜菌悬液的离心管置于超声波清洗仪中进行超声；

S2计数：用活菌计数法测定生物膜菌悬液的细菌数目，即为生物膜中的活菌数目。

2.根据权利要求1所述一种优化的生物膜活菌计数法，其特征在于，所述步骤S12超声分散是生物膜菌悬液在25℃下超声6min。

3.根据权利要求1或2所述一种优化的生物膜活菌计数法，其特征在于，所述生物膜为体外的牙菌斑生物膜模型。

4.根据权利要求3所述一种优化的生物膜活菌计数法，其特征在于，步骤S1中，所述牙菌斑生物膜模型使用24孔细胞培养板培养形成时，向牙菌斑生物膜模型的孔中加入100～200μL质量百分比为0.25％的胰酶溶液，常温消化5min后再沿孔壁向孔中加入BHI富集培养基至总体积为1mL，接着将生物膜吹打混匀重悬形成生物膜菌悬液。

5.根据权利要求4所述一种优化的生物膜活菌计数法，其特征在于，所述牙菌斑生物膜模型由以下步骤培养形成：

S01、在无氧气氛及恒温的环境中，分别对各种口腔致病菌在TSA补加培养基平板上划线培养2～6天至平板上出现大量菌苔；

S02、将经步骤S01培养后的各种口腔致病菌分别接种到BHI富集培养基，在无氧气氛及恒温的环境中分别培养1～3天至BHI富集培养基浑浊，得到各种口腔致病菌的成熟菌悬液；

S03、将步骤S02所得的各种成熟菌悬液添加到含附着力促进剂的BHI富集培养基中，每一种成熟菌悬液的体积百分比为2％～8％；然后在无氧气氛及恒温的环境中接种到成膜介质的孔中，培养14～18小时，在成膜介质的孔壁上形成孔型的牙菌斑生物膜模型；

所述TSA补加培养基是指每升TSA培养基中含有5克酵母提取物、0.5克L‑半胱氨酸氨酸盐酸盐、5毫克氯化血红素和1毫克维生素K1的培养基；

所述BHI富集培养基是指每升BHI培养基中含有1克蔗糖、1克葡萄糖、1克D‑甘露糖、0.5克L‑半胱氨酸氨酸盐酸盐、5毫克氯化血红素和1毫克维生素K1的培养基；

所述附着力促进剂为碳酸钙悬浊液，含附着力促进剂的BHI富集培养基中碳酸钙的质量百分比为0.1％～0.5％。

6.根据权利要求5所述一种优化的生物膜活菌计数法，其特征在于，含附着力促进剂的BHI富集培养基中碳酸钙的质量百分比为0.2％。

7.根据权利要求5所述一种优化的生物膜活菌计数法，其特征在于，所述口腔致病菌包含血链球菌、变异链球菌、粘性放线菌、鼠李糖乳杆菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌。

8.根据权利要求5所述一种优化的生物膜活菌计数法，其特征在于，所述无氧气氛是指由体积比为80％氮气、10％氢气和10％二氧化碳构成的气体环境。

9.根据权利要求5所述一种牙菌斑生物膜模型的培养方法，其特征在于，所述恒温的温度为36℃。