[发明专利]基于氧化透明质酸-II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料及制备方法

摘要

本发明涉及一种基于氧化透明质酸‑II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料及制备方法，由氧化透明质酸、II型胶原蛋白和自体浓缩骨髓有核细胞制成，材料中的自体浓缩骨髓有核细胞具有自我更新及成软骨分化潜能，参与软骨缺损修复，因此具有很好的软骨损伤修复效果，修复组织呈透明软骨样，修复组织表面平整度、与邻近正常软骨的整合程度、II型胶原蛋白含量、GAG含量、钙化软骨层及软骨下骨形态等方面均明显优于空白对照组，有临床转化的潜能。

主权项

1.基于氧化透明质酸‑II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料，其特征在于，由氧化透明质酸、II型胶原蛋白和自体浓缩骨髓有核细胞制成；氧化透明质酸、II型胶原蛋白和自体浓缩骨髓有核细胞的加入量按每2×106个自体浓缩骨髓有核细胞加入100mg II型胶原蛋白凝胶和10 μL 浓度为100mg/mL 的氧化透明质酸溶液；所述II型胶原蛋白由以下方法制备：将冻干软骨粉按质量体积比为20:1（g：L）用浓度为4 M盐酸胍溶液搅拌混悬，搅拌后置于4 ℃条件下，消化软骨粉基质中的粘多糖至匀浆状态；消化完全后，将消化产物在4℃、8000rpm条件下离心20 min，弃上清液，收集沉淀物，加水溶解，然后加入相当于盐酸胍溶液体积3/50倍的醋酸，加入相当于冻干软骨粉重量0.1倍的胃蛋白酶，加水至终体积为盐酸胍溶液的2倍，调节pH值于2.5‑3之间，然后在4℃条件下消化48 h；消化完毕后于立式高速离心机中8000 rpm离心20 min，弃沉淀，收集上清液；接着向上清液中缓慢倒入浓度为1.5 M的 NaOH溶液并搅拌至pH值为7.5时停止倒注，加入NaCl使其终浓度为3 M，4℃条件下，8000 rpm离心20 min，收集沉淀物；沉淀物分装至透析袋中待透析液电导率，接近纯水电导率时结束透析；将透析袋内粘稠胶状溶液在4℃条件下，立式高速离心机8000 rpm离心20 min，收集沉淀物至无菌容量瓶中，加入0.15 mol/L的盐酸溶液，溶解3天后白色沉淀蛋白分散、溶解呈凝胶状，搅拌均匀，分装，冻干，备用；所述氧化透明质酸由以下方法制备：配制成质量分数为2%的透明质酸溶液，然后加入0.1g/mL 的高碘酸钠溶液，搅拌，避光条件下完全氧化反应6小时，然后加入乙二醇终止反应，再将反应液灌入透析袋中至电导率接近纯水时结束透析，获得氧化透明质酸；所述自体浓缩骨髓有核细胞由以下方法制备：对目前动物进行麻醉，然后用已经使用1000 U/mL 肝素预湿的注射器抽取骨髓血，然后将抽取的抗凝骨髓液加入等体积的无菌PBS液，混匀，混匀后将骨髓液沿管壁缓慢注入到含等体积的浓度为1.073 g/mL 的Percoll胞分离液中，注入过程保持分离液与混合液体之间界面的完整，接着采用Percoll密度梯度离心法获取自体浓缩骨髓有核细胞，先以2000 rpm的速度离心混合液体15 min，吸取有核细胞层，加入 PBS溶液洗涤吸取的有核细胞，以1500 rpm的速度离心洗涤细胞5 min，弃上清；再次加入PBS吹打洗涤细胞，1000 rpm速度离心5 min，弃上清，加入 PBS重悬即得。