[发明专利]一种胎盘组织冻存、复苏和制备间充质干细胞的方法在审

专利信息
申请号: 201711451308.8 申请日: 2018-04-19
公开(公告)号: CN108192859A 公开(公告)日: 2018-06-22
发明(设计)人: 王健;熊华强;宋彩霞;胡小东 申请(专利权)人: 重庆斯德姆生物技术有限公司
主分类号: C12N5/0735 分类号: C12N5/0735;A01N1/02;C40B50/06
代理公司: 重庆百润洪知识产权代理有限公司 50219 代理人: 刘立春
地址: 400020 重庆*** 国省代码: 重庆;50
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摘要: 发明涉及一种胎盘组织冻存、复苏和制备间充质干细胞的方法,其包括如下步骤:对胎盘组织进行清洗;从组织剪下胎盘小叶,并用粉碎机粉碎;配制胎盘组织低温保护液备用;将粉碎后的组织与保护液混合后分装至冻存管中,先后在4℃下冷藏0.5小时,‑20℃冷藏2小时,‑80℃下冷冻1天,最后液氮中冷冻备用;需要时将胎盘组织冻存管从液氮中取出,恒温水浴解冻;使用缓冲液清洗后,双酶法消化胎盘组织;过滤收集细胞,使用间充质干细胞培养基培养与扩增间充质干细胞。本发明方法可有效冻存与复苏胎盘组织,制备间充质干细胞。
搜索关键词: 胎盘组织 间充质干细胞 冻存 制备 冻存管 复苏 液氮 冷藏 备用 冷冻 间充质干细胞培养基 低温保护液 缓冲液清洗 恒温水浴 胎盘小叶 保护液 粉碎机 双酶法 分装 剪下 扩增 解冻 配制 过滤 清洗 取出 并用 细胞 消化
【主权项】:
1.一种胎盘组织冻存、复苏和制备间充质干细胞的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:(1)通过PBS缓冲液清洗胎盘组织,使胎盘组织表面残留血液冲洗干净,胎盘表面无血液凝块;(2)使用组织剪剪下步骤(1)得到的胎盘组织的胎盘小叶,然后使用粉粹机将胎盘小叶粉粹成小块组织;(3)将步骤(2)获得的小块组织,按照1:1体积比加入预冷保护剂,混合均匀,分装至多个冻存管中,所述保护剂为玻璃化溶液与间充质干细胞培养基的混合液;(4)将步骤(3)获得的冻存管先后在4℃下冷藏0.5小时,‑20℃冷藏2小时,‑80℃下冷冻1天,最后在‑196℃液氮中冷冻备用;(5)需要时将步骤(4)冷冻的组织块从液氮中取出,在恒温水浴中解冻,用移液管吸取解冻的组织块,放入洁净的离心管中,加入PBS缓冲液混匀,然后离心,去掉上清液;(6)在步骤(5)清洗后的组织块中,先后加入0.1%II型胶原酶和0.25%胰酶进行消化,使用筛网过滤收集细胞溶液,然后离心,去掉上清液;(7)使用间充质干细胞培养基重悬步骤(6)获得的细胞沉淀,放入预先置有间充质干细胞培养基的培养瓶中,置于CO2培养箱内培养;以及(8)在培养后的3‑4天进行第一次换液,以后3‑4天换一次液,待细胞融合度达到70%以上后,使用胰蛋白酶进行消化后传代,即获得胎盘间充质干细胞。
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