[发明专利]用于免疫细胞的诱导扩增的培养箱

摘要

本发明提出了一种用于免疫细胞的诱导扩增的培养箱。该培养箱包括：箱体；氧气源；二氧化碳源；氧气浓度传感器；二氧化碳浓度传感器；控制器，所述控制器设置在所述箱体上并且分别与所述氧气源、所述氧气浓度传感器、所述二氧化碳源和所述二氧化碳浓度传感器相连，用于基于所述氧气浓度传感器和所述二氧化碳浓度传感器的数据控制所述氧气源和所述二氧化碳源，其中，在将单个核细胞接种到生物反应器中的第1天至第9天，所述控制器将所述培养空间中的CO2浓度控制在2～7％，优选5％，所述控制器将所述培养空间中的O2浓度控制在8％～10％；在将单个核细胞接种到生物反应器中的第10天至第22天，所述控制器将所述培养空间中的O2浓度控制在12～18％，优选15％，所述控制器将所述培养空间中的CO2浓度控制在2～7％。

主权项

1.一种用培养箱进行免疫细胞诱导扩增的方法，其特征在于:所述培养箱包括：箱体，所述箱体中限定出培养空间；氧气源，所述氧气源与所述箱体相连用于向所述培养空间中供给氧气；二氧化碳源，所述二氧化碳源与所述箱体相连用于向所述培养空间中供给二氧化碳；氧气浓度传感器，所述氧气浓度传感器设置在所述箱体内壁上用于检测所述培养空间中的氧气浓度；二氧化碳浓度传感器，所述二氧化碳浓度传感器设置在所述箱体内壁上用于检测所述培养空间中的二氧化碳浓度；控制器，所述控制器设置在所述箱体上并且分别与所述氧气源、所述氧气浓度传感器、所述二氧化碳源和所述二氧化碳浓度传感器相连，用于基于所述氧气浓度传感器和所述二氧化碳浓度传感器的数据控制所述氧气源和所述二氧化碳源；所述免疫细胞诱导扩增的方法具体步骤如下：准备抗人CD16包被的ZellWerk生物反应器在生物反应器中加入经医用生理盐水溶解的2.5μg/mL抗人CD16单克隆抗体15mL，轻轻晃动培养瓶使抗体铺满培养面，4℃避光过夜；使用前回收抗体包被液，用15mL生理盐水洗涤生物反应器一次，再用15mL的T细胞扩增培养基洗涤一次，所述T细胞扩增培养基是OpTmizerTMCTSTMT ‑cell expansion SFM ；采集外周血，分离外周血血浆和单个核细胞；用加入抗凝剂的无菌采血袋采集人外周血约100ml，预留1ml外周血做快检和血型鉴定，采血袋立即无菌封装，无菌4℃保存运输，准确记录采集信息；快检筛选合格后将外周血送入GMP实验室，若快检不合格，血样废弃处理；在GMP实验室中取出血袋，酒精消毒采血袋，观察无凝血和溶血后在超净台中打开血袋，将血液转移到至50ml无菌离心管中，≤40ml/管，2500rpm离心15min；转移上层血浆到另一离无菌离心管中，3500rpm离心15min，收集上清血浆到新的无菌离心管中，用口膜密封离心管口，血细胞用于分离单个核细胞；将血浆放到56℃水浴锅中水浴30‑50min灭活补体，3500rpm离心15min去除补体，10ml每支分装到15ml无菌离心管中，‑20℃冻存备用；并留取7.5ml血浆进行慢检：病毒五项、支原体、内毒素和微生物，其中病毒由第三方检测为准；将得到的血细胞沉淀用血浆等体积的生理盐水重悬后转移到250ml无菌玻璃瓶中，加入血液总体积1/3量的羟乙基淀粉，轻轻晃动盐水瓶使混合均匀，静置使红细胞沉降；待红细胞层沉降分层后，将上层乳白色悬液轻轻吸取到无菌离心管，1800rpm离心5min，弃去上清，沉淀用10ml生理盐水重悬；取无菌15ml离心管2支，各加入5ml常温人外周血淋巴细胞分离液，分别在上层轻轻加入各5ml细胞悬液；室温2000rpm慢升慢降离心25min；轻轻取出离心管，小心吸取界面中间云雾层白细胞至新的15ml离心管中，补加生理盐水洗涤2次；1ml生理盐水重悬细胞，取5μl细胞加入到245μl生理盐水中稀释50倍，计数，并用台盼蓝染色计细胞存活率；实验结束的带血污物均经过配比过得新洁尔灭浸泡过夜才能丢弃；预留4.5x106 个细胞进行流式抗体标记检测NK细胞的比例；剩余的单个核细胞细胞接种到加有50ml培养基的生物反应器中，培养基配比为：45mlOpTmizerTMCTSTMT‑cell expansion SFM 培养基+5ml自体血浆+终浓度1000IU/mlPepro Tech IL‑2 +终浓度0.01KE/ml沙培林，37℃，5％CO2无菌培养，记为第0天；每日观察细胞，并进行培养基更换，培养基配比为培养基配比为：OpTmizerTMCTSTMT ‑cell expansion SFM 培养基+10％自体血浆+终浓度1000IU/mlPeproTechIL‑2；当自体血浆已经用完时，不再补加血浆，即OOpTmizerTMCTSTMT ‑cell expansion SFM 培养基+终浓度1000IU/mlPepro Tech IL‑2 ；当培养至第9天时，更换培养体系，即SuperCultureTML500人淋巴细胞无血清培养基+终浓度1000IU/mlIL‑2+终浓度1mg/ml白酒草皂苷S，同时将氧气浓度提高到15％，每日观察细胞，并进行适当氧气浓度调整和培养基的更换；待14天时，进行细胞回收，留取10ml培养基上清进行Elisa分泌因子检测；将回收的细胞用200ml生理盐水重悬，并加入10ml人血清白蛋白，混匀；并从中取10ml细胞悬液待检，剩余的细胞注入回输袋中准备回输。