[发明专利]一种猪干扰素诱生剂的筛选方法

摘要

本发明公开一种猪干扰素诱生剂的筛选方法，包括以下步骤：体外培养猪小肠细胞IPEC‑1；培养稳定表达绿色荧光蛋白基因和猪干扰素β基因的细胞株IPEC‑1/AcGFP1‑IFN‑β；将细胞IPEC‑1/AcGFP1‑IFN‑β接种到培养板中形成细胞爬片；用待筛选诱生剂处理细胞IPEC‑1/AcGFP1‑IFN‑β，得待测细胞，并观测待测细胞的AcGFP1荧光强度，根据AcGFP1荧光强度筛选出猪干扰素诱生剂。本发明提出的猪干扰素诱生剂的筛选方法，具有具有筛选快速、针对性强、结果准确的优点，筛选出来的猪干扰素诱生剂可直接作为饲料添加剂加入仔猪饲料中，用于诱导仔猪体内产生干扰素而实现抵抗仔猪疾病的作用。

主权项

1.一种猪干扰素诱生剂的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S10、体外培养猪小肠细胞系，获得猪小肠上皮细胞IPEC‑1；步骤S20、以猪血基因组为模板，用猪干扰素β基因的特异性引物p1和p2进行PCR扩增，得到目的基因IFN‑β片段，并将目的基因IFN‑β片段与pMD18T克隆载体连接后进行培养，然后提取质粒，命名为pMD18T‑IFN‑β；步骤S30、用Xho I和Sal I酶对质粒pMD18T‑IFN‑β和含有绿色荧光蛋白基因的表达载体pIRES2‑AcGFP1进行双酶切，并回收目的基因IFN‑β片段和线性化的pIRES2‑AcGFP1载体片段，将目的基因IFN‑β片段与线性化的pIRES2‑AcGFP1载体片段连接后进行培养，然后提取重组质粒，命名为pIRES2‑AcGFP1‑IFN‑β；步骤S40、将猪小肠上皮细胞IPEC‑1接至孔板中，待细胞融合至75～85％时，转染重组质粒pIRES2‑AcGFP1‑IFN‑β和对照质粒pIRES2‑AcGFP1，转染22～26h后向IPEC‑1细胞中加入培养基继续培养，获得稳定表达AcGFP1和IFN‑β的细胞株，命名为IPEC‑1/AcGFP1‑IFN‑β；步骤S50、将细胞IPEC‑1/AcGFP1‑IFN‑β接至培养板上，用待筛选诱生剂处理细胞IPEC‑1/AcGFP1‑IFN‑β，70～74h后取出细胞爬片并观察细胞的AcGFP1荧光强度，并根据AcGFP1荧光强度，从待筛选诱生剂中筛选出猪干扰素诱生剂；其中，在步骤S20中，所述特异性引物p1的序列为5‑GCCTCGAGATGGCTAACAAGTGCA‑3，所述特异性引物p2的序列为5‑GGTCGACTCAGTTCCGGAGGTAAT‑3。