[发明专利]一种以活性红4为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法

摘要

本发明涉及一种以活性红4为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，属于大分子检测领域。本发明提供一种通过十二烷基硫酸钠增敏的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，本发明利用弱酸环境下，活性红4与壳聚糖分子结合形成的缔合物呈电中性，在此基础上加入十二烷基硫酸钠形成三元缔合物，缔合物体积增大，且疏水性大大提高，可导致在结合产物与水之间形成界面而产生一种表面增强的散射效应，从而使共振瑞利散射强度响应值有明显的提升。且在一定浓度范围内，共振瑞利散射强度与壳聚糖含量在一定的浓度范围内呈线性关系，以此作为壳聚糖的定量基础，建立了测定壳聚糖的共振瑞利散射法。本方法测定受壳聚糖的分子量和脱乙酰度的影响，具有试剂廉价，灵敏度高，重现性好和操作简便等优点。

主权项

1.一种以活性红4为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，其包括下述步骤：1)绘制ΔI和不同分子量的壳聚糖浓度的标准曲线向10mL比色管中加入1.0mL一定浓度梯度的壳聚糖标准溶液，1.0mL缓冲溶液，2.0mL浓度为1.72×10‑3mol/L的十二烷基硫酸钠溶液，以及1.0mL浓度为2.00×10‑5mol/L的活性红4溶液，使用三次蒸馏水定容至刻度，并充分摇匀，将其置于室温室温10min，取1ml混合溶液加入石英比色皿，于F‑2500型荧光分光光度计上，以λex＝λem进行同步扫描，分别记录含壳聚糖的各检测体系在最大共振瑞利散射波长λ＝370nm处体系的共振散射强度值I，其中试剂空白在λ＝370nm处体系的共振散射强度值I0，并计算ΔI＝I‑I0，建立ΔI与低分子壳聚糖浓度的标准曲线C1；使用中分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立ΔI与中分子壳聚糖浓度的标准曲线C2；使用高分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立ΔI与高分子壳聚糖浓度的标准曲线C3；2)10μg/mL的样品工作液的制备：将壳聚糖胶囊去胶囊壳，称取0.04g于100mL容量瓶中，用0.5mol/L冰醋酸溶解，定容得样品储备液。用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为10μg/mL的样品工作液。3)根据壳聚糖分子量选择标准曲线：使用步骤1)中检测方法绘制ΔI和样品工作液的标准曲线，并将其与不同分子量的壳聚糖标准曲线比较，根据样品的ΔI和样品工作液的标准曲线的回归方程确定样品中的壳聚糖的分子量的大小，根据所对应的壳聚糖的分子量的大小确定所使用的回归方程；4)样品中壳聚糖含量确定：取样品工作液1mL，按步骤1)检测方法进行测定，在λ＝370nm处测定其共振散射强度值I，并计算ΔI＝I‑I0，将ΔI代入线性回归方程求得样品中壳聚糖的含量，同时做加标回收试验。