[发明专利]芽孢杆菌宿主细胞的基因组编辑

摘要

本发明涉及用于修饰芽孢杆菌宿主细胞的基因组的方法，所述方法通过采用仅具有一个活性核酸酶结构域的II类Cas9酶，例如化脓性链球菌Cas9切口酶，以及用于每个靶序列的合适的指导RNA，以在至少一个基因组靶序列中产生位点特异性切口，随后通过将芽孢杆菌宿主细胞基因组的一个或多个修饰的供体部分通过经典的双重同源重组整合到一个或多个切口的每一侧来修复一个或多个切口。

主权项

1.一种用于修饰芽孢杆菌宿主细胞的基因组的方法，所述方法包括以下步骤：A.提供芽孢杆菌宿主细胞，所述芽孢杆菌宿主细胞包含：a)至少一个待修饰的基因组靶序列，其中每个靶序列侧接II类Cas9酶的功能性PAM序列；b)仅具有一个活性核酸酶结构域的II类Cas9酶的变体，c)针对每个待修饰的靶序列的单指导RNA或指导RNA复合物，所述RNA或RNA复合物包含：i)第一RNA，其包含20个或更多个核苷酸并且包含tracr配对序列，所述核苷酸与所述至少一个待修饰的基因组靶序列至少80％互补并且能够与所述至少一个待修饰的基因组靶序列杂交，以及ii)第二RNA，其包含与所述tracr配对序列互补并且能够与所述tracr配对序列杂交的tracr序列；以及d)至少一种包含所述芽孢杆菌宿主细胞基因组的一个或多个修饰的供体部分的多核苷酸构建体，所述供体部分包含具有一个或多个所希望的核苷酸修饰的至少一个基因组靶序列以及每侧位于所述一个或多个修饰侧翼的至少70个未修饰的核苷酸；其中所述第一RNA的20个或更多个核苷酸与所述至少一个基因组靶序列杂交，并且其中所述变体II类Cas9酶与所述单指导RNA或所述指导RNA复合物相互作用并且切割所述至少一个基因组靶序列，随后所述芽孢杆菌宿主细胞基因组的一个或多个修饰的供体部分通过所述切口每侧上的同源重组事件插入到所述基因组中，由此将所述一个或多个所希望的修饰引入所述基因组；以及B.选择芽孢杆菌宿主细胞，其中所述至少一个基因组靶序列已被修饰。