[发明专利]超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶

摘要

本文提供了使用具有ssRNA连接酶和ssDNA连接酶活性两者的超热稳定的赖氨酸‑突变型ssDNA/RNA连接酶的组合物、系统和方法。在某些实施方案中，使用此类超热稳定的赖氨酸‑突变型ssDNA/RNA连接酶来将具有5'腺苷酸化端的第一单链核酸序列连接至第二单链核酸序列(例如，在至少75℃的温度下)以形成连接的核酸序列。在其他实施方案中，对所述连接的核酸序列进行测序。

主权项

1.一种连接单链核酸的方法，所述方法包括：a)在反应混合物中组合以下各项：i)超热稳定的赖氨酸‑突变型ssDNA/RNA连接酶，所述连接酶是前体超热稳定的ssRNA连接酶的突变型式，其中所述前体超热稳定的ssRNA连接酶具有基序I EKx(D/N/H)G(SEQ ID NO:32)并且在至少75℃的温度下具有ssRNA连接酶活性，但不具有ssDNA连接酶活性，并且其中所述超热稳定的赖氨酸‑突变型ssDNA/RNA连接酶在所述基序I中的所述K(赖氨酸)处具有氨基酸取代，并且在至少75℃的温度下具有ssRNA连接酶和ssDNA连接酶活性两者，ii)具有腺苷酸化的5'端碱基的第一单链核酸序列，以及iii)具有3'端碱基的第二单链核酸序列；以及b)在至少75℃的温度下孵育所述反应混合物，以使得所述超热稳定的赖氨酸‑突变型ssDNA/RNA连接酶将所述第一单链核酸序列的所述5'腺苷酸化端连接至所述第二单链核酸序列的所述3'端以形成连接的核酸序列。