[发明专利]能够检测密切相关的等位基因的多重核酸测定方法及其试剂

摘要

本发明披露了用于引物依赖性核酸扩增方法的多部分引物。还披露了多重测定方法、相关的试剂盒和用于此类方法的寡核苷酸。

主权项

1.一种多重测定方法，其能够在10,000个拷贝的相关的野生型靶序列的存在下在样本中扩增和检测至少两种不同的密切相关的、预期的罕见突变体DNA靶序列中的每一种的少至十个拷贝，其中这些突变体靶序列与彼此以及该野生型序列相差少至单核苷酸多态性，该多重测定方法包括：(a)制备非对称引物依赖性扩增反应混合物，该混合物包括该样本；DNA聚合酶；脱氧核糖核苷三磷酸；扩增所需的其他试剂；可区分标记的均相荧光检测探针，例如分子导标探针，该均相荧光检测探针对每种罕见突变体靶序列的扩增产物是特异的；过量浓度的针对这些密切相关的突变体靶序列的共同的常规反向引物；以及限制浓度的针对该每种预期的罕见突变体靶序列的独特的多部分引物，其中每种多部分引物的序列在5'至3'方向上包含通过延伸该反向引物复制的以下四种连续DNA序列：与任何靶序列不互补的标签序列，在由该共同反向引物引发的扩增子链中的该标签序列的互补物是该探针的靶，并且该标签序列对于要单独识别的每种靶序列或靶序列组是独特的；锚定序列，该锚定序列足够长使得其能够在引物退火过程中与这些密切相关的突变体靶序列和该相关的野生型靶序列杂交；独特的桥序列，该独特的桥序列至少六个核苷酸长，其在引物退火期间不与该引物预期的靶序列杂交，不与任何其他密切相关的突变体靶序列杂交，或在引物退火过程中不与该相关的野生型靶序列杂交；和独特的足序列，该独特的足序列7至14个核苷酸长并且与该预期的靶序列完全互补，但与突变体靶序列和该相关的野生型序列彼此存在一个或更多个核苷酸不匹配，该一个或更多个核苷酸中的至少一个是3'末端核苷酸或3'倒数第二核苷酸，其中：(i)如果该多部分引物的锚定序列和足序列都与其预期的靶序列杂交，则在该靶序列中存在至少八个核苷酸长的间插序列，该间插序列在引物退火期间不与该引物的桥序列杂交，并且该桥序列和该间插序列在所得杂交体中产生泡状物，该泡状物具有18至40个核苷酸的周长，(ii)如果该多部分引物的锚定序列和足序列都与所述预期的靶序列杂交，该泡状物将足序列杂交体与锚定序列杂交体分离，并且该分离的足序列杂交体是弱杂交体，该弱杂交体使得复制预期的靶序列的可能性不大，如与使用常规引物发生的阈值(CT)相比，CT中至少五个循环的延迟所证明的，(iii)在PCR扩增期间，针对其预期的靶序列的多部分引物将引发任何密切相关的突变体靶序列或该相关的野生型靶序列的复制的概率比引发其预期的靶序列的复制的概率低至少1,000倍，如由至少十个热循环的阈值差异(ΔCT)所证明的；(iv)产生扩增子链的多部分引物具有桥序列和足序列，这些桥序列和足序列与该扩增子链的互补链完全互补；和(v)每种多部分引物的桥序列的长度和序列，连同其预期的靶序列的间插序列的长度，产生了对一种仅含有十个拷贝的其预期的靶序列的样本观察到的阈值(CT)，该CT将在指数扩增的60个循环中出现并且与从不含有拷贝的样本中观察到的CT是可区分的；和(b)重复地循环该反应混合物以扩增在该样本中存在的这些密切相关的罕见突变体靶序列，并通过经由实时或端点检测测量来自每种可区分地标记的探针的荧光强度来检测那些序列的存在。