[发明专利]第二链引导

摘要

本文提供了用于制备高通量cDNA测序文库的方法和组合物。

主权项

1.一种对cDNA多核苷酸标签化的方法，所述方法包括：‑提供双链mRNA：cDNA杂合体，所述杂合体包含具有5′末端和3′末端的第一链cDNA多核苷酸，并与具有5′末端和3′末端的互补mRNA杂交，其中第一链cDNA多核苷酸的5′末端包含第一衔接体序列或其互补序列；‑合成与第一链cDNA多核苷酸互补并与第一链cDNA多核苷酸杂交的一种或多种第二链cDNA多核苷酸，其中合成包括：i)使mRNA：cDNA杂合体与包含RNA酶H活性的酶接触，从而产生与第一链cDNA杂交的mRNA片段，和ii)使mRNA片段与DNA聚合酶接触，从而在模板引导的聚合酶反应中延伸mRNA片段，其中模板是第一链cDNA多核苷酸，并形成双链cDNA多核苷酸；‑任选地使一种或多种第二链cDNA多核苷酸与DNA连接酶接触；‑使双链cDNA多核苷酸与载有衔接体的标签酶接触，从而形成包含标签化的双链cDNA多核苷酸的反应混合物，所述标签化的双链cDNA多核苷酸包含第一末端和第二末端，其中第一末端包含所述第一衔接体序列及其互补序列，并且第二末端包含第二衔接体序列及其互补序列，‑其中mRNA的5′末端是单链的；或者‑其中mRNA的5′末端包含DNA：RNA杂合体，并且其中所述方法包括在反应混合物中扩增标签化的双链cDNA，所述反应混合物包含第二和第三扩增引物和与第一末端杂交的第一扩增引物，其中第二或第三扩增引物与第二末端杂交；或者‑其中所述使双链cDNA多核苷酸与载有衔接体的标签酶的接触在含有载有同型衔接体的标签酶并且不含有具有不同衔接体的载有衔接体的标签酶的反应混合物中进行。