[发明专利]多核苷酸改组方法

摘要

本发明的第一个目的是提供一种制备Tile载体的方法，所述Tile载体是包含选择性标记和编码多核苷酸的载体，其中所述编码多核苷酸的前面和后面紧接着Ms型识别序列,其中所述前面的和后面的识别序列被相同的IIs型限制性内切酶识别，但具有相反的方向。更具体地，所述前面的和后面的IIs型识别序列的位置和方向提供了所述Tile载体被相应的IIs型限制性内切酶裂解，导致在其各个末端处含有具有已知的方向和长度的突出端序列同时缺少所述前面的和后面的Ms型识别序列的所述编码多核苷酸序列的释放。本发明的第二个目的是提供使用如前面所述获得的Tile载体连接两个或更多个编码多核苷酸以形成产物多核苷酸的方法。典型地，所述产物多核苷酸整合在载体中。

主权项

1.一种制备Tile载体(24)的方法，所述Tile载体(24)包含选择性标记(6)以及前面和后面紧接着IIs型识别序列(12)的编码多核苷酸序列(10),其中所述前面的和后面的识别序列被相同的IIs型限制性内切酶识别，但具有相反的方向，/n其中所述Tile载体能够使用识别所述前面的和后面的识别位点的IIs型限制性内切酶裂解，导致在其各末端具有已知的突出端序列的所述编码多核苷酸序列的释放，所述释放的编码多核苷酸序列缺少所述前面的和后面的IIs型识别序列；/n所述方法包括下列步骤：/na)提供初始编码多核苷酸(8)并用第一末端序列(16)和第二末端序列(17)延伸所述多核苷酸的各个末端，其中所述末端序列中每一个包含下列元件：/ni.编码延伸序列(11)(3xn),所述编码延伸序列(11)(3xn)邻接所述初始编码多核苷酸的各个末端并在所述初始编码多核苷酸的开放阅读框的框内加入；/nii.邻接所述编码延伸序列的第一IIs型识别序列(12)，其中所述第一识别序列被定向成使得识别所述第一识别位点的IIs型限制性内切酶能够在所述编码延伸序列内裂解从而产生突出端，并且其中所述第一末端序列和第二末端序列的所述第一IIs型识别序列被相同的IIs型酶识别，但具有相反的方向；/niii.邻接所述第一IIs型识别序列或在所述第一IIs型识别序列内的间隔区序列(13)；/niv.邻接所述间隔区序列的第二IIs型识别序列(14)，其中所述第二识别序列被定向成使得识别所述第二识别序列的IIs型限制性内切酶能够裂解所述间隔区序列从而产生间隔区突出端，并且其中所述第二IIs型识别序列不被识别所述第一IIs型识别序列的IIs型酶识别；/nv.尾序列(15)，所述尾序列(15)具有足够的长度以便允许IIs型限制性内切酶与所述第二识别序列结合；/nb)提供接收载体(1)，所述接收载体(1)包含第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列包含定位于第一IIs型识别序列(3)和第二IIs型识别序列(4)之间的选择性标记(6)，使得所述载体能够使用识别所述第一IIs型识别序列(3)和第二IIs型识别序列(4)的IIs型识别酶裂解，从而形成：/n■填充序列(2)，所述填充序列(2)包含所述第一IIs型识别序列(3)和第二IIs型识别序列(4)；和/n■选择性载体片段(7)，所述选择性载体片段(7)包含所述选择性标记(6)但缺少所述第一IIs型识别序列和第二IIs型识别序列并且具有非互补的末端突出端，其中一个突出端与在使用识别所述第一末端序列的所述第二IIs型识别序列的IIs型识别酶裂解所述第一末端序列后获得的间隔区突出端互补，而另一突出端序列与通过使用识别所述第二末端序列的所述第二IIs型识别序列的IIs型限制性内切酶裂解所述第二末端序列获得的间隔区突出端互补；/nc)孵育混合物，其中所述混合物包含：/ni.步骤(a)的延伸的初始编码多核苷酸；/nii.步骤(b)的接收载体；/niii.识别所述延伸的初始编码多核苷酸的末端序列的所述第二IIs型识别序列的IIs型限制性内切酶；/niv.识别所述接收载体的所述第一IIs型识别序列和第二IIs型识别序列的IIs型限制性内切酶；/nv.DNA连接酶。/n