[发明专利]一种新型甲基化建库方法及其应用

摘要

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种新型甲基化建库方法及其应用。本发明提供的新型甲基化建库方法，可适用于对于重亚硫酸盐处理的DNA样品进行单链连接、扩增或文库构建。采用先进行重亚硫酸盐处理后再连接黏末端接头的方法，极大减少了由于药物处理造成DNA断裂导致的样品信息损失。 1

主权项

1.一种甲基化建库方法，包括如下步骤：

(1)对样本的基因组DNA进行重亚硫酸盐转化；

(2)对步骤(1)中重亚硫酸盐转化后的样本基因组DNA进行处理，使其维持单链DNA状态；

(3)将步骤(2)中获得的单链DNA与黏性末端接头进行连接，获得一端带有接头的单链DNA；

(4)对步骤(3)中获得的一端带有接头的单链DNA进行延伸，形成一端带有接头的双链DNA；

(5)采用双链接头连接到步骤(4)所得一端带有接头的双链DNA的另一端，形成双端带有接头的双链DNA；

(6)对步骤(5)获得的双端带有接头的双链DNA进行扩增，获得甲基化测序文库。

2.根据权利要求1所述的甲基化建库方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述样本基因组DNA来自单细胞样本或多细胞样本。

3.根据权利要求1所述的甲基化建库方法，所述步骤(3)中，所述黏性末端接头为带有黏性末端的双链接头，所述黏性末端接头的一端为第一黏性末端，所述第一黏性末端至少包括随机序列。

4.根据权利要求3所述的甲基化建库方法，其特征在于，所述黏性末端接头的另一端为平末端或第二黏性末端。

5.根据权利要求4所述的甲基化建库方法，其特征在于，当所述黏性末端接头的另一端为第二黏性末端时，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)所述第二黏性末端为任意序列或A/T/C/G寡核苷酸的重复序列，优选的为重复序列；(2)所述第二黏性末端的长度为2‑10nt，优选为2‑5nt。

6.根据权利要求3所述的甲基化建库方法，其特征在于，所述第一黏性末端包括随机序列及特殊序列。

7.根据权利要求6所述的甲基化建库方法，其特征在于，所述特殊序列为序列确定的序列。

8.根据权利要求3所述的甲基化建库方法，其特征在于，所述第一黏性末端的长度为2‑30nt，优选为4‑20nt，更优选为5‑10nt。

9.根据权利要求3所述的甲基化建库方法，其特征在于，所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链的长度为10‑70nt，优选为10‑30nt，更优选为10‑25nt。

10.根据权利要求3所述的甲基化建库方法，其特征在于，所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链的退火温度为10‑100℃，优选为20‑80℃，更优选为30‑60℃。

11.根据权利要求3所述的甲基化建库方法，其特征在于，(1)所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链的5’端进行磷酸化修饰；(2)所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链的5’端进行间臂(spacer)修饰；(3)所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链的5’端进行氨基修饰；(4)所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链的5’端采用甲基化修饰的重复A/T/C/G序列；(5)所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链的3’端进行生物素化修饰；(6)所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链的3’端进行间臂(spacer)修饰；(7)所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链的3’端进行氨基修饰。

12.根据权利要求3所述的甲基化建库方法，其特征在于，所述黏性末端接头中，不带有第一黏性末端的那条单链称为另一条单链。

13.根据权利要求12所述的甲基化建库方法，其特征在于，所述黏性末端接头中，另一条单链的长度为10‑70nt，优选为10‑30nt，更优选为10‑25nt。

14.根据权利要求12所述的甲基化建库方法，其特征在于，所述黏性末端接头中，另一条单链的退火温度为10‑100℃，优选为20‑80℃，更优选为30‑60℃。

15.根据权利要求12所述的甲基化建库方法，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)所述黏性末端接头中，另一条单链的5’端进行磷酸化修饰；(2)所述黏性末端接头中，另一条单链的5’端进行间臂(spacer)修饰；(3)所述黏性末端接头中，另一条单链的5’端进行氨基修饰；(4)所述黏性末端接头中，另一条单链的5’端进行磷酸化修饰；(5)所述黏性末端接头中，另一条单链的3’端进行生物素化修饰；(6)所述黏性末端接头中，另一条单链的3’端进行间臂(spacer)修饰；(7)所述黏性末端接头中，另一条单链的3’端进行氨基修饰。

16.根据权利要求1所述的甲基化建库方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述黏性末端接头通过连接酶连接到所述单链DNA上。

17.根据权利要求16所述的甲基化建库方法，其特征在于，所述连接酶选自HiFi Taq DNA连接酶、T4 RNA连接酶2、连接酶、9°N^TM DNA连接酶、Taq DNA连接酶、T7 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、电转连接酶、平末端/TA连接酶预混液、瞬时黏性连接酶预混液、T4 DNA连接酶、T4RNA连接酶、Circligase ssDNA ligase、5′AppDNA/RNA热稳定连接酶中的任一种或多种。

18.根据权利要求1所述的甲基化建库方法，其特征在于，所述步骤(4)中，延伸时所用试剂选自DNA聚合酶、dNTPs、DNA聚合酶缓冲液、延伸引物。

19.根据权利要求18所述的甲基化建库方法，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)所述DNA聚合酶选自vent DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、Klenow片段、DNA聚合酶I(E.coli)、Therminator^TM DNA聚合酶、Sulfolobus DNA聚合酶IV、phi29 DNA聚合酶、Bst2.0DNA聚合酶、Bst 2.0DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Deep VentR(exo–)DNA聚合酶、Deep VentR^TM DNA聚合酶、VentR(exo–)DNA聚合酶、DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、

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