[发明专利]一种基于CRISPR-Cas10核酸蛋白复合物的快捷核酸检测定量法

摘要

本发明属于核酸检测与定量领域，具体涉及到一种基于CRISPR‑Cas10核酸蛋白复合物的快捷核酸检测定量法。本发明利用CRISPR‑Cas核酸蛋白复合物既特异性切割靶标RNA，又能高效地、非特异性地切割单链DNA的双重核酸切割活性，进行核酸检测及定量；利用单链DNA作为报告探针，使得该方法更为稳定、成本更低；本方法能对6.4 pM‑2 nM浓度范围内的靶标核酸进行精准定量，将核酸蛋白复合物进行突变，可提高核酸检测灵敏度到100 fM，是一种全新的更为简便的核酸定量技术。

主权项

1.一种基于CRISPR‑Cas10核酸蛋白复合物的快捷核酸检测定量法，包括以下步骤：（a）确定待检样品靶标核酸序列；（b）如果待检核酸样品中的靶标核酸为单链RNA，即可直接进行步骤（c），如果受检核酸样品中的靶标核酸为双链或者单链DNA，则需要利用RNA聚合酶将其转录成单链RNA，再进行步骤（c）；（c）生产携带与步骤（b）中靶标核酸RNA序列配对的crRNA的CRISPR‑Cas10核酸蛋白复合物，所述的CRISPR‑Cas10核酸蛋白复合物通过原核生物细胞内源表达共纯化方式获得；（d）在检测反应体系中加入适量待检测样品、 步骤（C）生产的CRISPR‑Cas10核酸蛋白复合物以及单链DNA探针；所述的单链DNA探针的5’端和3’端分别标记荧光基团和淬灭基团；（e）将检测反应体系放置在20‑75℃下反应30‑90分钟，待检测反应结束后，通过荧光酶标仪或荧光分光光度计，检测反应的荧光值，进行定性分析；（d）对靶标RNA进行定量：配制不同浓度的靶标核酸标准品，绘制荧光值与浓度对应的标准曲线，再根据受检样品的荧光值计算其靶标核酸的浓度。