[发明专利]一种同时负载化学药物和纳米材料的外泌体的制备方法

摘要

本发明公开了一种同时负载化学药物和纳米材料的外泌体的制备方法，包括如下步骤：1)利用“经典的差速超速离心法”从细胞培养上清液中提取细胞分泌的外泌体；2)利用电穿孔的方法将水溶液中的姜黄素和纳米四氧化三铁同时载入外泌体；3)测量OD260nm(RNA特征吸收峰)验证穿孔成功；4)穿孔后将混合液立即放入细胞培养箱孵育1小时，以促进外泌体膜修复；5)100000g超速离心除去游离的姜黄素和纳米四氧化三铁，得到同时载姜黄素和纳米四氧化三铁的复合外泌体。该方法简单易行，成功率高，制得的复合外泌体中姜黄素和纳米四氧化三铁的荷载量均能满足体内外治疗及成像要求为包括肿瘤在内的多种慢性疾病的靶向性诊断和治疗提供了新的工具。

主权项

一种同时负载化学药物和纳米材料的外泌体制备方法，其特征在于：所述的外泌体内部载有可用于肿瘤示踪和成像的纳米四氧化三铁以及可用于肿瘤治疗的姜黄素；其中纳米四氧化三铁为水溶液，姜黄素为二甲基亚砜DMSO溶液，其具体制备步骤如下：1)从小鼠巨噬细胞Raw264.7培养液中提取该细胞分泌的外泌体，采用经典的差速超速离心法，得到的外泌体重悬于含50mM海藻糖的PBS溶液中，‑80℃保存备用；2)将制备好的纳米四氧化三铁水溶液、姜黄素DMSO溶液及外泌体混悬液加入所述的海藻糖PBS溶液中，震荡混匀，得到样品；3)按电穿孔仪要求及电穿孔皿规格加入相应体积的上述样品，放入电穿孔仪中，按照预实验摸索的最佳穿孔条件设定参数，进行穿孔；4)穿孔后立即取样，在紫外可见光分光光度计上检测样品在260nm处的吸光值，并与未穿孔样品对比，判断穿孔是否成功；5)其余穿孔后样品立即放入细胞培养箱中孵育1个小时，以促进外泌体膜修复；6)1小时后，将上述液体以10万‑14万g RCF离心力超速离心70‑100min，弃尽上清，沉淀物即为同时负载纳米四氧化三铁和姜黄素的外泌体，称之为复合外泌体；7)上述复合外泌体加入共聚焦培养皿中，荧光显微镜下观察姜黄素自发绿色荧光证明包载姜黄素成功，上述外泌体制备铜网样品，于电镜下观察外泌体内铁颗粒，证明纳米四氧化三铁负载成功；8)PBS重悬复合外泌体，用菲啰啉分光光度法测定铁含量，用可见光分光光度计测定姜黄素含量，以蛋白计，用BCA法测外泌体含量；9)取复合外泌体混悬液进行纳米颗粒跟踪分析检测NTA或动态光反射分析DLS测定其粒径大小及分布范围，并在透射电镜TEM下观察其大小及形貌特征，western blot检测外泌体膜表面特征性蛋白表达；10)将上述复合外泌体混悬液分装放于‑80℃冰箱中，每隔一周取样一次测定上述浓度及外泌体特征，评价复合外泌体的稳定性。