[发明专利]一种快速获得siRNA干扰BLM解旋酶稳定细胞株的方法

摘要

本发明公开了一种快速获得siRNA干扰BLM解旋酶稳定细胞株的方法，包括下列步骤:1)设计与合成siRNA；2)构建siRNA表达载体；3)克隆转化干扰载体；4)转染shRNA；5)利用流式细胞仪进行阳性细胞分选：将荧光蛋白GFP阳性细胞按1个细胞分选到1个孔的方式分选到含全血清培养基的微孔板中；6)培养分选得到的阳性细胞，提取细胞总RNA，设计BLM基因引物，实时荧光定量QRT‑PCR检测BLM基因在mRNA水平的表达，选择BLM解旋酶沉默表达的细胞株，扩大培养并冻存即可。本发明具有细胞株获得简单快速，省时省力，假阳性率较低的特点。

主权项

1.一种快速获得siRNA干扰BLM解旋酶稳定细胞株的方法，其特征在于：包括下列步骤:1)siRNA的设计与合成：根据NCBI上BLM解旋酶基因的靶序列按照siRNA的设计原则，设计合成针对BLM解旋酶基因的干扰序列，并在序列两端分别加上BamH I/EcoR I酶切位点；2)siRNA表达载体的构建：将干扰序列退火并用BamH I和EcoR I双酶切，纯化回收，与同样经BamH I和EcoR I双酶切并纯化过的空载体连接构建重组干扰载体；3)干扰载体的克隆转化：将重组的干扰载体转化到大肠杆菌DH5a，筛选阳性菌落，提取质粒进行双酶切鉴定并送测序，获得BLM解旋酶siRNA载体，并扩大培养；4)shRNA的转染：将干扰载体通过质脂体介导的转染方式转染前列腺癌细胞系，转染24～48小时后进行分选；5)利用流式细胞仪进行阳性细胞分选：将荧光蛋白GFP阳性细胞按1个细胞分选到1个孔的方式分选到含全血清培养基的微孔板中；6)培养分选得到的阳性细胞，提取细胞总RNA，设计BLM基因引物，实时荧光定量QRT‑PCR检测BLM基因在mRNA水平的表达，选择BLM解旋酶沉默表达的细胞株，扩大培养并冻存即可。