[发明专利]重组乙肝核心抗原的分离纯化方法有效
申请号: | 201810006942.9 | 申请日: | 2018-01-04 |
公开(公告)号: | CN108047316B | 公开(公告)日: | 2021-06-15 |
发明(设计)人: | 李建强;任苏林;顾月;周童;孙洪林;葛君;戚凤春;鲍梦汝;韩杰;陈晓晓 | 申请(专利权)人: | 远大赛威信生命科学(南京)有限公司 |
主分类号: | C07K14/02 | 分类号: | C07K14/02;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/16 |
代理公司: | 北京泛华伟业知识产权代理有限公司 11280 | 代理人: | 李渤;郭广迅 |
地址: | 210032 江苏省南京*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | 本发明涉及一种重组乙肝核心抗原的分离纯化方法,该方法包含热变性澄清、硫酸铵沉淀、超滤浓缩和洗滤换液、解聚合、第一步分子筛层析、超滤浓缩、洗滤和换液、复聚和第二步分子筛层析等步骤。该方法可获得的高纯度、低宿主残留、颗粒结构均一、高度稳定的重组乙肝核心抗原,即该方法具有抗原纯度高、宿主蛋白及宿主核酸残留低、抗原颗粒均一且易于工业化放大等特点。 | ||
搜索关键词: | 重组 乙肝 核心 抗原 分离 纯化 方法 | ||
【主权项】:
1.一种重组乙肝核心抗原的分离纯化方法,该方法包括如下步骤:1)取发酵后的菌体细胞,用缓冲液重悬菌体后获得起始菌悬液,破碎细胞,离心得到上清液;2)将步骤1)得到的上清液置于40~60℃水浴中,50~200rpm下震荡0.5~2小时,然后离心得到上清液;3)向步骤2)得到的上清液逐滴加入硫酸铵溶液,使得硫酸铵的终浓度维持在10%~30%饱和度,静置后离心,沉淀用含150mM NaCl的pH 8.0的50~100mM Tris-HCl缓冲液重悬,离心得到上清液;4)将步骤3)得到的上清液进行超滤浓缩,然后进行超滤洗滤换液,洗滤缓冲液为pH9.5~10.8的0.1M NaHCO3 -Na2 CO3 缓冲液,收获回流端样品,得到洗滤换液样品;5)向步骤4)得到的洗滤换液样品加入包含0~2mM DTT的6~8M尿素溶液,使抗原浓度保持在0.25~1.0mg/mL,pH维持在9.5~10.8,50~200rpm下搅拌解聚,得到解聚样品;6)将步骤5)得到的解聚样品进行分子筛层析,所述分子筛层析树脂为Sepharose 6FF或Sephacryl S-300,洗脱液为包含0~2mM DTT的pH 9.5~10.8的0.1M NaHCO3 -Na2 CO3 缓冲液,收集二聚体峰样品;7)将步骤6)得到的二聚体峰样品进行超滤浓缩,浓缩液先用pH 9.5~10.8的0.1MNaHCO3 -Na2 CO3 缓冲液进行超滤洗滤,然后以含0.65~1.25M NaCl的pH 6.5~7.8的0.1M磷酸盐缓冲液进行超滤洗滤换液,收获回流端样品,得洗滤换液样品;8)50~200rpm下搅拌步骤7)得到的洗滤换液样品,得到复聚样品;9)将步骤8)得到的复聚样品进行分子筛层析,所述分子筛层析树脂为ToyopearlHW65S或Toyopearl HW65F,洗脱液为含0.05~0.15M NaCl的pH 7.2的20~50mM磷酸盐缓冲液,收集目的抗原峰,得纯化的重组乙肝核心抗原;优选地,所述乙肝核心抗原是全长或截短的核心抗原;优选地,所述菌体细胞为原核细胞或真核细胞,例如大肠杆菌、毕赤酵母、汉逊酵母、酿酒酵母、昆虫细胞或中华仓鼠卵母细胞。
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