[发明专利]一种鉴别水稻稻瘟病广谱抗性基因Bsr-d1的分子标记方法

摘要

本发明涉及一种鉴别水稻稻瘟病广谱抗性基因Bsr‑d1的分子标记方法，属于生物工程技术领域。设计一对正、反引物，对不同水稻植株DNA进行扩增，扩增产物如果能够切成99bp、214bp的特征条带即为含Bsr‑d1基因的纯合体；如果不能够酶切，只含有313bp的特征条带即为不含Bsr‑d1基因的纯合体；如果同时存在99bp、214bp和313bp的三条特征条带，则为Bsr‑d1基因的杂合体。本发明不仅能快速、准确地鉴定水稻种质资源或其育种群体中是否含有稻瘟病广谱抗性基因Bsr‑d1，同时能进一步区分Bsr‑d1基因的纯合体和杂合体，预测后代基因型，大大提高对水稻稻瘟病抗性的选择效率，加速育种进程。 1

主权项

1.一种鉴别水稻稻瘟病广谱抗性基因Bsr‑d1的分子标记方法，其特征在于，所用特异性分子标记引物CAPs5‑1序列为：

正向引物CAPs5‑1‑F序列为5'‑AGTCTAGCATCCACCGTTCCAC‑3'

反向引物CAPs5‑1‑R序列为5'‑GTAGGCAGGCAGTGGGATGA‑3'。

2.根据权利要求1所述的一种鉴别水稻稻瘟病广谱抗性基因Bsr‑d1的分子标记方法，其特征在于，用权利要求1所述Bsr‑d1基因特异性引物CAPs5‑1扩增水稻植株的基因组DNA，扩增产物经过限制性内切酶酶切，如果能够切成99bp、214bp的特征条带即为含Bsr‑d1基因的纯合体；如果不能够酶切，只含有313bp的特征条带即为不含Bsr‑d1基因的纯合体；如果同时存在99bp、214bp和313bp的三条特征条带，则为Bsr‑d1基因的杂合体。

3.根据权利要求1或2所述的一种鉴别水稻稻瘟病广谱抗性基因Bsr‑d1的分子标记方法，其特征在于，20μL PCR反应体系包括：10×PCR Buffer(Mg²⁺)2.0mL，dNTP(10mmol/L)0.5μL，5U/μL的Taq酶0.2μL，10pmol/L的正向引物1.0μL，10pmol/L的反向引物1.0μL，DNA2.0μL，ddH₂O 13.3μL。

PCR反应条件包括：94℃预变性5min,然后94℃变性1min、58℃退火1min、72℃延伸1.5min,32个循环,最后72℃延伸10min,10℃冷却10min后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应；反应结束后扩增产物加入指示剂，将扩增产物在1.5％琼脂糖上进行电泳，DuRed染色，紫外凝胶成相系统保存图像；

4.根据权利要求1或2所述的一种鉴别水稻稻瘟病广谱抗性基因Bsr‑d1的分子标记方法，其特征在于，对CAPs5‑1扩增的PCR产物进行AIUⅠ酶切，酶切反应体系为10μL，分别为PCR反应产物5μL，10×Buffer R 1μL，AIUⅠ(10U/μL)0.1μL，ddH₂O 3.9μL，混匀后再在37℃恒温水浴锅酶切5‑8h，酶切产物在1.5％琼脂糖上进行电泳，DuRed染色，经紫外凝胶成相系统成像。

5.根据权利要求3所述的一种鉴别水稻稻瘟病广谱抗性基因Bsr‑d1的分子标记方法，其特征在于，对CAPs5‑1扩增的PCR产物进行AIUⅠ酶切，酶切反应体系为10μL，分别为PCR反应产物5μL，10×Buffer R 1μL，AIUⅠ(10U/μL)0.1μL，ddH₂O 3.9μL，混匀后再在37℃恒温水浴锅酶切5‑8h，酶切产物在1.5％琼脂糖上进行电泳，DuRed染色，经紫外凝胶成相系统成像。