[发明专利]一种微载体生物反应器培养猪圆环病毒2型的方法

摘要

本发明公开了一种微载体生物反应器培养猪圆环病毒2型的方法，包括以下步骤：1）转瓶细胞消化，2）细胞过滤，3）细胞接毒上罐培养，4）24h换液，5）收获一收抗原，6）再次消化细胞上罐，7）收获二收抗原并换液培养，8）收获三收抗原，9）将一收抗原、二收抗原和三收抗原融化，分别过滤去除微载体，得到抗原液并进行效价检测。本发明方法能够提高细胞贴壁效率，减少细胞团块，提高细胞密度，并且能够提高单批抗原收获量，提高抗原效价，降低生产成本。

主权项

1.一种微载体生物反应器培养猪圆环病毒2型的方法，其特征在于：其包括以下步骤：1）转瓶细胞消化：将转瓶PK-15细胞用胰酶消化液消化细胞，将消化后的细胞摇匀；2）细胞过滤：使用10-20微米的细胞过滤器过滤细胞，得到细胞液，取少量过滤后的细胞液用维持液进行4-6倍稀释，然后取少量稀释后细胞液加至细胞计数板进行细胞计数，计算出过滤后细胞液的细胞密度；3）细胞接毒上罐培养：将微载体按3-5g/升加入生物反应器中，同时加入7-9倍微载体体积的含血清的营养液，将猪圆环病毒2型毒种按培养体积的1-5%的量加入细胞液中，然后将细胞液加入生物反应器中，所述细胞液的加入量根据细胞液密度按每个微载体30-50个细胞计算，调节生物反应器中的细胞培养参数，其中，温度为36.5-37.5℃，DO为50-60%，PH为7.2-7.4，搅拌转速为40-60r/min，开启通气系统进行细胞培养；4）24h换液：当生物反应器中细胞培养至24h后，停止加热和搅拌，关闭通气系统，静置3-5分钟，排出细胞培养液，然后加入等量的细胞维持液，开启通气系统，继续在加热和搅拌条件下培养细胞；5）收获一收抗原：当生物反应器中细胞培养至48-52h后，停止加热和搅拌，关闭通气系统，静置3-5分钟，收获上清液，为一收抗原，开启通气系统，继续在加热和搅拌条件下培养细胞，将一收抗原置于-15℃下冷冻保存；6）再次消化细胞上罐：再次将转瓶PK-15细胞按照步骤1）和2）进行转瓶细胞消化和细胞过滤，得到细胞过滤液，然后将细胞过滤液加入生物反应器中培养，所述细胞过滤液的加入量满足10-20个细胞/个微载体，调节生物反应器中的细胞培养参数，其中，温度为36.5-37.5℃，DO为50-60%，PH为7.2-7.4，搅拌转数为40-50r/min，开启通气系统进行细胞培养，8-10h后将搅拌转数调为50-60 r/min；7）收获二收抗原并换液培养：当生物反应器中细胞培养至96 h后，停止加热和搅拌，关闭通气系统，静置3-5分钟，再次收获上清液，为二收抗原，将二收抗原置于-15℃下冷冻保存，重新加入等量的细胞维持液继续培养，调节生物反应器中的细胞培养参数，其中，温度为36.5-37.5℃，DO为50-60%，PH为7.2-7.4，搅拌转数为50-60r/min，开启通气系统，继续在加热和搅拌条件下培养细胞；8）收获三收抗原：当反应器中细胞培养至120-144h后，调节搅拌转数为100-150r/min，搅拌3-5分钟，停止加热，关闭通气系统，再次收获上清液，为三收抗原，将三收抗原置于-15℃下冷冻保存；9）冻融、过滤收获抗原液：将一收抗原、二收抗原和三收抗原融化，分别过滤去除微载体，得到抗原液并进行效价检测。