[发明专利]一种提高重金属污染土壤中植物抗性的双接菌方法

摘要

本发明公开了一种提高重金属污染土壤中植物抗性的双接菌方法。步骤一：菌株的培养与菌悬液的获取；双接种体系所用的菌株为野生型根瘤菌S.meliloti CCNWSX0020和植物促生菌胶冻样芽孢杆菌P.Mucilaginosus ACCC10013；步骤二：苜蓿种子催芽处理；步骤三：根瘤菌‑芽孢杆菌双接菌于苜蓿。该方法通过构建根瘤菌与促生菌双接种的方法缓解重金属对植物的毒害作用，增加植物生物量，提高植物抗性和提取重金属的能力，同时促进污染地区土壤养分循环，为矿区重金属污染土壤的生物修复技术植物管理措施提供新的策略。

主权项

1.一种提高重金属污染土壤中植物抗性的双接菌方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：菌株的培养与菌悬液的获取：双接种体系所用的菌株为根瘤菌S.meliloti CCNWSX0020和促生菌胶冻样芽孢杆菌P.Mucilaginosus ACCC10013；菌株培养过程中所用的培养基如下：YMA固体培养基：10g/L甘露醇，3g/L酵母粉，0.5g/L K2HPO4，0.2g/L MgSO4·7H2O，0.1g/L NaCl，17g/L琼脂，pH为6.8～7.2TY液体培养基：5.0g/L胰蛋白胨，3.0g/L酵母粉，0.7g/L CaCl2·2H2O，pH为6.8～7.2改良ACCC55固体培养基：10.0g/L蔗糖，0.5g/L酵母粉，0.5g/L K2HPO4·3H2O，0.2g/L NaCl，0.2g/L MgSO4·7H2O，1.0g/L CaCO3，15.0～20.0g/L琼脂，pH为7.0～7.2优化液体培养基：2.5g/L麦芽糖，1.0g/L胰蛋白胨，0.73g/L MgSO4·7H2O，0.4g/L K2HPO4·3H2O，0.06g/L NaCl，0.6mg/L FeCl3，10mg/L水杨酸，1.0g/L CaCO3，pH为7.0～7.2S.meliloti菌株首先在YMA固体培养基中活化，然后将S.meliloti菌种接种到YMA固体培养基平板上，28℃培养3d后，挑取菌落，转化，使菌株活化，并纯化分离出单一菌落，最后把活化好的菌株接种于TY液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养24h直至OD600为0.8，培养液于8000rpm，4℃离心5min收集菌体，菌体用无菌去离子水清洗2～3次，重新悬浮于去离子水中的即为实验所需菌悬液，菌悬液需现用现配；P.Mucilaginosus菌株首先在改良的ACCC55固体培养基中活化，然后将P.Mucilaginosus菌株接种到ACCC55固体培养基平板上，28℃培养3d后，挑取菌落，转化，使菌株活化，并纯化分离出单一菌落，最后把活化好的菌株接种于优化液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养24h直至OD600为0.8，培养液于8000rpm，4℃离心5min收集菌体，菌体用无菌去离子水清洗2～3次，重新悬浮于去离子水中的即为实验所需菌悬液，菌悬液需现用现配；步骤二：苜蓿种子催芽处理步骤三：双接菌处理将1.3kg的铜矿区和铅锌矿区农业土壤分别装入花盆中，花盆下面垫上细纱网以防土壤以及土壤中重金属淋失，控制土壤含水量为土壤田间持水量的70％，土壤平衡一周后，将已经催芽至1‑2cm的20株苜蓿植入土壤中；待紫花苜蓿长出第一片真叶，将20ml S.meliloti菌悬液和P.Mucilaginosus菌悬液用注射器添加到植物根部，每隔一周接菌一次，共接菌3次。