[发明专利]一种哈茨木霉菌基因敲除方法

摘要

本发明涉及一种哈茨木霉菌基因敲除方法。一种哈茨木霉基因敲除方法，包括(1)构建敲除基因片段；(2)PEG‑CaCl₂原生质体转化；(3)菌落PCR筛选阳性突变子。本发明通过建立一套完整的哈茨木霉基因敲除方法，同源同组效率达到20％；同时结果菌落PCR技术，极大缩短获得阳性转化子的周期，高效敲除靶标基因。

主权项

1.一种哈茨木霉基因敲除方法，其特征在于包括:（1）构建敲除基因片段:以木霉基因组DNA为模板，分别PCR扩增目标基因约1200 bp的5’和3’端同源臂，以引物Hyg‑F和Hyg‑R扩增潮霉素抗性基因，Hyg‑F与扩增5’同源臂的反向引物设置16 bp的重叠区域；Hyg‑R与扩增3’同源臂的正向引物设置16 bp的重叠区域；BamHI 酶切载体pUC19，利用一步法无缝克隆试剂盒对5’端同源臂、潮霉素抗性基因、3’端同源臂和pUC19线性载体进行体外重组并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用5’同源臂的上游引物5F和3’同源臂的下游引物3R扩增敲除片段验证阳性克隆；引物5F和3R进行PCR扩增大量制备敲除片段，纯化敲除片段使敲除片段浓度达到500 ng/μL；（2）PEG‑CaCl2原生质体转化:PEG‑CaCl2原生质体转化包括：制备哈茨木霉原生质体；将哈茨木霉原生质体悬浮液、纯化敲除片段、PEG溶液；用枪头混匀；加PEG溶液，轻轻混匀，常温下放置；加溶液B，轻轻混匀；将混合液涂布在覆盖层析纸的含1 M蔗糖PDA平板上，层析纸预先剪成条形；28℃避光培养24 h；将条形层析纸片转到含抗生素的PDA平板上，28℃，避光培养30‑36 h，待条形层析纸边缘长出菌落后，挑取菌落，转接至新鲜的抗生素平板上，培养2天；其中所述的溶液B配方为：1 Msorbitol，50 mM CaCl2，10 mM TrisHCl，pH 7.5；所述的PEG溶液配方为：25% PEG6000，50 mM CaCl2、10 mM TrisHCl，pH 7.5；（3）菌落PCR筛选阳性突变子: 直接刮取少量哈次木霉菌丝体，裂解后离心，利用菌落PCR试剂盒共同筛选阳性突变转化子；其中使用的引物1以5’端同源臂的上游序列设置正向引物，潮霉素基因序列设置反向引物，跨5’端同源序列扩增片段；引物2以潮霉素基因序列设置正向引物，3’端下游序列设置反向引物，跨3’端同源序列扩增片段。