[发明专利]一种绿色荧光蛋白的融合表达方法

摘要

本发明涉及一种绿色荧光蛋白的融合表达方法，包括酶切、连接、转质及测序，其中,通过使用PCI、CIA、醋酸钠进行洗脱，通过梯度离心除掉反应体系中的杂质。将目的DNA片段和载体片段分别进行CIAP处理，使目的DNA片段和载体片段的末端成为粘性末端，提高连接成功率。减少了测序操作由于杂质存在而影响测序的准确性。得到的DNA纯度较高。步骤操作简单，重现性好，试剂消耗少，降低实验成本，其电泳效果与试剂盒操作相当。

主权项

1.一种绿色荧光蛋白的融合表达方法，包括酶切、连接、转质及测序，其特征在于，其中具体包括以下步骤：(1)绿色荧光蛋白酶切方法1)绿色荧光蛋白EcoRI酶酶切将绿色荧光蛋白、灭菌水、缓冲液及EcoRI酶加入到离心管中，在水浴下加热，再依次加入溶液PCI、CIA、醋酸钠分别进行离心浓缩，去除溶液中多余的脂类、糖类杂质，得到具有EcoRI酶酶切位点的绿色荧光蛋白DNA，保存到TE溶液中；2)绿色荧光蛋白HindIII酶酶切将上步获得的具有EcoRI酶酶切位点的绿色荧光蛋白DNA溶液，灭菌水、缓冲液、HindIII酶进行水浴下加热，再分别加入溶液PCI、CIA、醋酸钠分别离心浓缩，去除溶液中多余的脂类、糖类杂质，得到具有EcoRI酶和HindIII酶两个酶切位点的目的DNA片段，保存到TE溶液中；(2)表达载体酶切方法1)表达载体EcoRI酶酶切将表达载体、灭菌水、缓冲液及EcoRI酶加入到离心管中，在水浴下加热35‑40℃，加热时间1‑1.5h，通过电泳确认酶切结果，再依次加入溶液PCI、CIA、醋酸钠分别进行离心浓缩，去除溶液中多余的脂类、糖类杂质，得到具有EcoRI酶酶切位点的表达载体，并保存在TE溶液中；2)表达载体HindIII酶酶切将上步得到具有EcoRI酶酶切位点的表达载体与灭菌水、缓冲液、HindIII酶进行水浴下加热，再依次加入溶液PCI、CIA、醋酸钠分别离心，得到具有EcoRI酶和HindIII酶两个酶切位点的载体片段，保存在TE溶液中；(3)CIAP处理将目的DNA片段和载体片段分别进行CIAP处理，使目的DNA片段和载体片段的末端成为粘性末端；(4)目的DNA片段酶切后的精制CIAP处理处理后的目的DNA片段溶液用固相萃取小柱萃取，用洗脱溶液对目的DNA片段溶液进行洗脱，通过离心将目的DNA片段截留下来，保存在无核水中。