[发明专利]一种可促进血管快速生成的骨组织工程支架

摘要

本发明为一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架及其制备。本发明中，采用超临界流体强制分散溶液技术制备载有PDGF(血小板衍生生长因子)的PLLA(左旋聚乳酸)微球，再利用超临界二氧化碳发泡技术将微球、VEGF(血管内皮细胞生长因子)和FGF‑2(碱性成纤维细胞生长因子)三者共同载入PLGA(聚乳酸‑羟基乙醇酸)多孔支架中，最后在支架上种植血管内皮细胞，构建可协同调控血管生成的复合支架。本发明中，种植的血管内皮细胞可分化为新血管，其分泌的细胞外基质可提高相关细胞的粘附，三种血管诱导因子的次第释放可诱导血管的生长，三者协同作用可促进骨修复过程中血管的快速生成。本发明制备操作简单，所制得的复合支架具有良好的生物相容性及功能性，在组织工程修复体中具有应用前景。 1

主权项

1.一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架的制备方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：

(1)PDGF‑PLLA微球的制备：将PDGF溶于二甲亚砜，PLLA溶于二氯甲烷中。当两种溶液都完全溶解后，将两者混合均匀。混合后的溶液经过高效液相色谱(HPLC)泵泵入高压沉积反应釜中，经历超临界流体强制分散溶液技术(SEDS)过程。沉淀析出的微球收集后储存于‑20℃待用。

(2)复合支架的制备：将羟基磷灰石(HA)与PLGA按1:4‑1:2例研磨，加入一定量的PDGF‑PLLA载药微球，以及FGF‑2和VEGF冻干粉(FGF‑2和VEGF冻干粉先用10 000r/min或12 000r/min，离心30s，重悬于pH 7.6，5mmol/L Tris至0.1g/L，加入事先混合好的PLGA、HA和PDGF‑PLLA微球粉末中轻轻混匀后冻干)，将混合粉末放入直径为1‑8mm的圆柱形模具中室温下进行压制得到小圆片，取出。然后置于聚四氟乙烯圆柱体模具内并将模具放入超临界CO₂不锈钢反应釜中，采用超临界CO₂发泡技术制备多孔复合支架。

(3)血管内皮细胞的种植：将复合支架放置于24孔板内，紫外线照射0.5h。再用75％酒精消毒，PBS浸泡清洗3次。将无菌的复合支架放置在DMEM培养液中孵育过夜。第4代血管内皮细胞经过培养消化后，制备成密度为1×10⁵/ml的细胞悬液，分别种植于已准备好的支架材料上，37℃，5％CO₂细胞培养箱中继续培养24h。

2.根据权利要求1所述的一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架的制备方法，其特征在于，步骤1中，采用SEDS制备PDGF‑PLLA微球时，通过双通道喷嘴分别将试验溶液和超临界CO₂(SCCO₂)喷入高压反应釜中。当溶液接触到SCCO₂后，溶剂被SCCO₂萃取，使得试验溶液变成溶质的过饱和溶液，溶质从溶液中已微球的形式结晶析出。结束泵样后，维持压力和温度不变，继续通入CO₂淋洗30‑60分钟以去除残留有机溶剂。

3.根据权利要求1所述的一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架的制备方法，其特征在于，步骤1中，采用SEDS制备PDGF‑PLLA微球的反应条件为：温度31‑35℃，压强8‑15Mpa，SCCO₂流速200‑400ml/min，试验溶液流速为0.1‑0.5ml/min。

4.根据权利要求1所述的一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架的制备方法，其特征在于，步骤1中，采用SEDS制备PDGF‑PLLA微球时：PDGF的用量为0.1‑0.2mg，二甲基亚砜的用量为1‑2.5mL。PLLA的分子量为1‑10ku，用量为100‑200mg，二氯甲烷的用量为10‑40mL。

5.根据权利要求1所述的一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架的制备方法，其特征在于，步骤2中，采用超临界CO₂发泡技术制备多孔复合支架的反应条件为：密封后用液泵将冷凝至0℃以下的CO₂压入反应釜内，反应压力为8‑10MPa时开始升温，反应温度为30‑37℃，通过仪器内置的热电偶和放空阀调节釜内的压力和温度，保持温度变化不超过±0.5℃，压力变化为±0.1Mpa。反应8h后，以一定的速率放气，减压速率为0.1‑0.5MPa/s。

6.根据权利要求1所述的一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架的制备方法，其特征在于，步骤2中，采用超临界CO₂发泡技术制备多孔复合支架时：PLGA的分子量为1‑100ku，嵌段比为50:50‑75:50，HA的用量为2‑10％，PDGF‑PLLA微球的用量为5‑40％，FGF‑2和VEGF冻干粉的用量为10‑50μg。

7.根据权利要求1所述的一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架的制备方法，其特征在于，释放第1至7天，VEGF、FGF‑2和PDGF的累计释放率分别为71.10、69.76和43.17％。释放第7至21天，VEGF、FGF‑2和PDGF的累计释放率分别为11.14、10.91和28.49％。生长因子释放初期以血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(FGF‑2)为主，中后期以血小板衍生生长因子(PDGF)为主，能够满足血管生长不同时期对生长因子的需要，实现生长因子对血管再生的协同诱导作用。