[发明专利]一种适用于无缝克隆的嵌合酶的制备方法

摘要

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其一种适用于无缝克隆的嵌合酶的制备方法，本发明将噬菌体T7 5’‑3’单链外切酶和T4 DNA多聚酶进行混合，实现无缝克隆，为进一步增强反应体系重复性和降低生产成本，将噬菌体T7 5’‑3’单链外切酶和T4 DNA多聚酶进行进行融合表达，构建成嵌合蛋白，在大肠杆菌进行表达和纯化。该融合蛋白更适合于无缝克隆体系，应用效果好，成本低，更适合产业化，在酶作用后的体系中添加脱氧核糖核苷三磷酸，可进一步提高克隆效率。

主权项

1.一种适用于无缝克隆的嵌合酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：将噬菌体T7的5’‑3’单链外切酶和T4 DNA多聚酶的基因，用PCR扩增后，回收二个基因的片段，二个片段中有一部分同源，将二个片段加入到PCR管子中，用噬菌体T7的5’‑3’单链外切酶基因的氨基端引物和T4 DNA多聚酶的基因羧基端引物，进行PCR扩增，得到5’‑3’单链外切酶和T4 DNA多聚酶融合基因片段，琼脂糖胶回收后，通过Nde I和Xho I位点亚克隆到pET28a表达载体中进行表达形成嵌合蛋白；步骤二：将上述的嵌合蛋白的表达载体导入到大肠杆菌BL21(DE3)，进行表达，得到预期的嵌合蛋白；步骤三：将步骤二所得的提取蛋白经离子交换、氮三乙酸螯合亲和层析和肝素琼脂糖凝胶层析，得到纯化的嵌合蛋白；步骤四：将纯化的嵌合蛋白保存于磷酸钾、氯化钾、二硫苏糖醇和50％甘油的保存液中，即得到所述的嵌合酶。