[发明专利]一种基于硅基多肽的生物纳米磁珠制备及其应用

摘要

本发明公开了一种基于硅基多肽的生物纳米磁珠的制备方法，包括以下步骤：S10，构建细菌磁颗粒膜蛋白基因mamC或mamF的缺失突变体菌株，即一级重组菌株；S20，构建硅基多肽和细菌磁颗粒膜蛋白MamC或者MamF的基因融合表达载体；得到的表达载体导入到一级重组菌株中，筛选表达硅基多肽的二级重组菌株；S30，通过对二级重组菌株的培养发酵，生产表达展示硅基多肽的生物纳米磁珠；S40，以展示硅基多肽的生物纳米磁珠作为种子原料，在生物纳米磁珠表面进行硅基化修饰和氧化硅沉淀，得到具有氧化硅外壳和表面多肽的新型生物纳米磁珠；所述硅基多肽为silaffins多肽。

主权项

1.一种基于硅基多肽的生物纳米磁珠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S10，构建细菌磁颗粒膜蛋白基因mamC或mamF的缺失突变体菌株，即一级重组菌株；

S20，构建硅基多肽和细菌磁颗粒膜蛋白MamC或者MamF的基因融合表达载体；得到的表达载体导入到一级重组菌株中，筛选表达展示硅基多肽的二级重组菌株；

S30，通过对二级重组菌株的培养发酵，生产表达展示硅基多肽的生物纳米磁珠；

S40，以展示硅基多肽的生物纳米磁珠作为种子原料，在生物纳米磁珠表面进行硅基化修饰和氧化硅沉淀，得到硅沉积或硅基化修饰的生物纳米磁珠；

所述硅基多肽为silaffins多肽。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述silaffins多肽为YR‑SiP1、YR‑SiP2、YR‑SiP3中的一种；

YR‑SiP1的序列为：GAGAGSGAGA GSKKKKRHKK KKRHKKKKRH KKKKK；

YR‑SiP2的序列为：GAGAGSGAGA GSEEEETAEE EEDAEEEEDE AKEEEEEEEE；

YR‑SiP3的序列为：GAGAGSGAGA GSGAGAGSSS KKSGSYSGSK GSKRRILGAG AGSSSKKSGS YSGSKGSKRR IL。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述YR‑SiP1、YR‑SiP2或YR‑SiP3的基因序列如下：

YR‑SiP1：5‑GGTGCCGGTG CTGGTTCAGG TGCTGGTGCT GGTTCAAAGA AGAAGAAGCG GCACAAGAAG AAGAAGCGGC ACAAGAAAAA GAAGCGGCAC AAGAAGAAGA AGAAA‑3、

YR‑SiP2：5‑GGTGCCGGTG CTGGTTCAGG TGCTGGTGCT GGTTCAGAGG AGGAAGAAAC TGCAGAGGAA GAAGAAGATG CAGAGGAAGA AGAGGACGAG GAAGCTAAGG AGGAGGAGGA AGAGGAAGAA GAA‑3、

YR‑SiP3：5‑GGTGCCGGTG CTGGTTCAGG TGCTGGTGCT GGTTCAGGTG CTGGTGCTGG TTCATCCTCT AAGAAAAGCG GCAGTTACAG CGGCTCTAAG GGCAGTAAAA GGAGGATCCT GGGTGCTGGT GCTGGTTCAT CCTCTAAGAA AAGCGGCAGT TACAGCGGCT CTAAGGGCAG TAAAAGGAGG ATCCTG‑3中的一种。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S10步骤包括：

设计两对；引物分别扩增mamC或mamF基因两侧约500bp的同源DNA片段，通过分子克隆构建一条基于噬菌体病毒的微载体序列AAV‑del‑mamC或AAV‑del‑mamF；

AAV‑del‑mamC或AAV‑del‑mamF通过质粒提取及酶切步骤得到足够量的核酸序列产物，调节浓度为2mg/mL，通过电转化的方式同时转入MSR‑I野生型菌株中，电转化方案：方波电脉冲，电压3100V‑3200V，电脉冲时间是3.1‑3.3ms，电脉冲次数是1‑2次；

电转化后菌株通过蔗糖和抗生素庆大霉素梯度浓度压力筛选双交换突变菌株，经测序技术验证后，获得mamC或mamF缺失突变的重组菌株，即一级重组菌株MSRI‑dC或MSRI‑dF。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述20步骤包括：

通过DNA合成的方法制备所述YR‑SiP1、YR‑SiP2或YR‑SiP3的基因序列，用linker将表达基因序列和部分的mamC基因进行融合，得到pmamC‑Sip1、pmamC‑Sip2或pmamC‑Sip3新的融合基因片段；

将pmamC‑Sip1、pmamC‑Sip2或pmamC‑Sip3分别克隆到表达载体pBRC上，得到表达质粒pBRC‑pmamC‑Sip1、pBRC‑pmamC‑Sip2或pBRC‑pmamC‑Sip3；

通过三亲本接合或者电转化的方式将pBRC‑pmamC‑Sip1、pBRC‑pmamC‑Sip2或pBRC‑pmamC‑Sip3转入一级重组菌MSRI‑dC中，验证正确后得到表达多肽的重组菌株，即二级重组菌株。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述Linker对应的氨基酸序列为(GGASVGALAGSLIGAL)*n，n优选为3‑5；

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S30步骤包括：

表达YR‑SiP1、YR‑SiP1或YR‑SiP1的二级重组菌株经过转接、发酵培养后，磁装置收集菌体，磷酸缓冲液洗涤，破碎菌体后提取纯化生物纳米磁珠。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：

通过三角瓶先预培养，5％‑10％的O₂含量，培养时间16小时，培养温度37℃；

将预培养菌株转接到发酵罐中进行深层培养，5％‑10％的O₂，1％‑3％H₂，87％‑94％N₂，培养时间3‑4天，培养温度37℃。

9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S40步骤包括以下步骤：

所述展示硅基多肽的生物纳米磁珠溶于磷酸盐缓冲液中，超声反应，持续搅拌；

预先配置一定量的TEOS溶于盐酸中，搅拌水解，制备新鲜的正硅酸；

往展示硅基多肽的生物纳米磁珠磷酸盐溶液中滴加新鲜的正硅酸溶液和APMS溶液，样品振荡反应；

收集磁珠，用去离子水洗涤，去除未反应的硅酸和磷酸盐，即得硅沉积或硅基化修饰的生物纳米磁珠。

10.如权利要求1‑9任一所述的方法制备的磁珠及其在吸附核酸中的应用。