[发明专利]一种紫外诱导桑叶中Diels-Alderase酶的分离纯化方法及其用途

摘要

本发明公开了一种紫外诱导的桑叶中Diels‑Alderase酶的分离纯化方法及其用途。所述制备方法包括以下步骤：(1)选取新鲜采摘桑叶，经紫外诱导后匀浆；(2)离心后所得粗酶液经硫酸铵沉淀收集硫酸铵沉淀部分；(3)沉淀经缓冲液复溶后，样品经过疏水性层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析和凝胶过滤层析分离，浓缩后得到目标蛋白Diels‑Alderase酶。本发明提供的从紫外诱导桑叶中获得的Diels‑Alderase酶不仅纯度高且活性保持良好；Diels‑Alderase酶具有高效催化合成chalcomoracin的作用；chalcomoracin具有显著的抗肿瘤活性，可应用于制备新型抗肿瘤药物。

主权项

1.一种紫外诱导桑叶中Diels-Alderase酶的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：取经过紫外光照射后的诱导桑叶，以1:5～1:10g/ml的比例加入pH为6.5～8.0的PBS缓冲液，匀浆后于3～5℃条件下浸提1.5～2.5h，离心得到上清液；步骤2：向步骤1得到的上清液中加入硫酸铵，然后离心收集上清液，向上清液中继续加入硫酸铵，再次离心获得沉淀，将沉淀加入含0.7～0.9M硫酸铵的PBS缓冲液复溶；所述PBS缓冲液复溶pH为7.0～8.0，浓度为50～100mM；步骤3：将步骤2复溶得到的溶液经过疏水性凝胶层析，收集具有Diels-Alderase酶活性的组分并合并；步骤4：将步骤3中合并后的活性组分经过阴离子离子交换层析，再次收集具有Diels-Alderase酶活性的组分并合并；步骤5：将步骤4中合并后的活性组分经过阳离子离子交换层析，再次收集具有Diels-Alderase酶活性的组分并合并；步骤6：将步骤5中合并后的活性组分进行凝胶过滤层析，最终获得Diels-Alderase酶。