[发明专利]一种痕量丝素蛋白富集方法

摘要

本发明公开了一种痕量丝素蛋白富集方法，包括以下步骤：1）不同丝素蛋白单克隆抗体的混合；2）耦联反应；3）免疫磁珠的获得；4）鉴定；5）耦联后免疫磁珠的丝素蛋白单克隆抗体固定化；6）丝素蛋白单克隆抗体免疫磁珠与丝素蛋白的结合；7）丝素蛋白的洗脱；8）检测；9）加标回收。本发明利用丝素蛋白的复合单克隆抗体制备免疫磁珠，并利用这种免疫磁珠富集痕量丝素蛋白，可以更好地进行考古土样中痕量丝素蛋白的提取，具有提取不同分解片段、富集效率高、操作简便、实验耗时短等多方面优势。

主权项

1.一种痕量丝素蛋白富集方法，其特征在于包括以下步骤：不同丝素蛋白单克隆抗体的混合：取自鼠的重链分别为IgG1、IgG2b、IgA的三种丝素蛋白单克隆抗体同质量浓度混合；耦联反应：取蛋白 G包裹磁珠1mg加入到1mL、 pH为6.0、浓度为15mmol/L的2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，然后加入步骤1）中制备的混合抗体70μg，置于振荡器上室温耦联反应过夜；免疫磁珠的获得：用磁力架收集步骤2）中偶联反应后的磁珠并去除上清液，得到重链分别为IgG1、IgG2b、IgA的丝素蛋白单克隆抗体免疫磁珠；鉴定：另取1mg未偶联的磁珠和步骤3）中偶联后的磁珠在55‑65℃下烘干，进行傅里叶红外检测，观察1541cm‑1处的特征峰，确定耦联状态；耦联后免疫磁珠的丝素蛋白单克隆抗体固定化：在步骤3）中得到的丝素蛋白单克隆抗体免疫磁珠中加入1ml新鲜配制的浓度为0.2mol/L、PH为8.2的三乙醇胺溶液，三乙醇胺溶液中含有20mmol/L的邻苯二甲酸二甲酯，混合后的溶液置于振荡器上以保证磁珠处于悬浮状态，在室温孵育30min；孵育完成后用磁力架收集磁珠并去除上清液，接着用1mL磷酸缓冲盐溶液洗涤交联后的磁珠2‑4次，然后再用1mL的磷酸盐吐温缓冲液洗涤磁珠1‑3遍，最后用1mL含0.02% NaN3、0.1%牛血清蛋白的磷酸缓冲盐溶液重悬磁珠，并保存于4℃冰箱；丝素蛋白单克隆抗体免疫磁珠与丝素蛋白的结合：把步骤5）最终得到的免疫磁珠置于振荡器上以保证磁珠处于悬浮状态，在常温下孵育1h；每毫升免疫磁珠中加入含有10～100ng的丝素蛋白样品，置于振荡器上以保证磁珠处于悬浮状态,并在25℃反应60min；然后用磁力架收集磁珠并去除上清液，接着用1mL磷酸缓冲盐溶液洗涤交联后的磁珠3次；丝素蛋白的洗脱：加入100uL洗脱溶液与步骤6）得到的磁珠混匀，洗脱溶液是甘氨酸，浓度为0.1mol/L、PH为2，把磁珠置于振荡器上以保证磁珠处于悬浮状态，在室温孵育10min；然后用磁力架收集磁珠，上清液转移到另一个小管中，重复一次收集洗脱液；检测：合并步骤7）中的洗脱液，并用0.1mol/L NaOH溶液调整pH为7后进行ELISA检测；加标回收：在10～100ng丝素蛋白添加到每mL免疫磁珠中时，丝素蛋白的富集效率达到80%以上。