[发明专利]一种敌百虫降解菌株的分离筛选方法

摘要

本发明提供一种敌百虫降解菌株的分离筛选方法，该方法操作步骤包括1)土壤的采集；2)培养基的制备；3)梯度驯化法对敌百虫降解菌株富集驯化；4)敌百虫降解菌株的分离、鉴定；5)探究该菌株对敌百虫的降解特性，从而分析菌株对敌百虫污染土壤的生物修复潜力。本发明筛选出的菌株是在以敌百虫为唯一碳源的无机盐固体培养基中分离得到，同时该方法可用于其他有机磷农药降解菌的筛选；所得到的菌株为土壤本源微生物，是一种可降解敌百虫的新型菌种，可能应用于敌百虫污染土壤的生物修复中；本发明采用气相色谱‑质谱法测定菌株对敌百虫的降解效果，操作简单，准确度高。

主权项

1.一种敌百虫降解菌株的分离筛选方法，其特征在于：(1)降解菌株的富集培养：向100ml含敌百虫100ml/L的富集培养基中加入4g土壤，在25～30℃，180r/min下振荡培养7天；以5～10％的接种量将上述混合液接种到新鲜培养基中，提高敌百虫浓度至200mg/L；之后每培养7后天转接一次，其中敌百虫的浓度依次增加至300mg/L，400mg/L，500mg/L；(2)降解菌株的驯化培养：取步骤(1)中培养的最终菌液，以5～10％的接种量转接到无机盐培养基中，添加敌百虫浓度为500mg/L，25～30℃，180r/min下进行驯化培养，培养7天后驯化结束；(3)降解菌株的分离：将步骤(2)中驯化后的菌液，稀释104～105后，涂布于以敌百虫为唯一碳源的无机盐培养基固体平板上，28～35℃恒温倒置培养3～5天，能够生长的菌株即为能够以敌百虫为唯一碳源的降解菌株；(4)降解菌株的纯化：根据步骤(3)中生长菌株的外观形态，挑取菌落在含有敌百虫的选择性LB培养基固体平板上多次划线分离纯化菌株，28～35℃恒温倒置培养3～5天，最终得到单菌落；(5)降解菌株的保存：挑取步骤(4)中生长的单菌落于-80℃冰箱中保存；(6)菌株降解特性研究：将步骤(3)中单菌落在LB培养基中过夜培养制成种子液，然后接种10ml于100～150ml无机盐培养基中，其中以敌百虫为唯一碳源，浓度为400～600mg/L，25～30℃，180r/min振荡培养，每隔一天取样测定其中敌百虫含量。