[发明专利]一种制备雌性胚胎致死家蚕品系的方法及其中间品系和构建体

摘要

本发明公开了一种制备雌性胚胎致死家蚕品系的方法及其中间品系和构建体。将家蚕品系W‑Cas9和家蚕品系Tra2‑sgRNA交配，获得G2代，即雌性胚胎致死家蚕品系。制备W‑Cas9的方法包括以下步骤：1)制备TALEN双质粒，其中左边TALEN识别序列为序列表中SEQ ID NO:1，右边TALEN识别序列为序列表中SEQ ID NO:2，体外转录获得TALENs mRNA；2)构建配体质粒，其包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：TALENs靶点、左同源臂、Cas9基因表达盒、右同源臂和TALENs靶点；3)共转家蚕新鲜卵得G0代，G0代自交得G1代，即得。本发明利用TALENs和CRISPR/Cas9技术在家蚕中定点靶向胚胎发育必须基因，致使胚胎发育期所有雌性均致死，从而建立家蚕雄性专养品系，可以大幅提高家蚕生丝品质。

主权项

1.一种制备雌性特异性表达绿色荧光蛋白和Cas9蛋白的家蚕品系W‑Cas9的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备TALEN双质粒，其中左边TALEN识别序列为序列表中SEQ ID NO:1所示，右边TALEN识别序列为序列表中SEQ ID NO:2所示，体外转录获得其TALENs mRNA；2)构建配体质粒，所述的配体质粒包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：TALENs靶点、左同源臂、Cas9基因表达盒、右同源臂和TALENs靶点，所述的TALENs靶点包含从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：所述的左边TALEN识别序列、间隔序列和所述的右边TALEN识别序列，所述的左同源臂的序列和家蚕的基因组中TALENs靶点的左侧序列相同，所述的右同源臂的序列和家蚕的基因组中TALENs靶点的右侧序列；3)将所述的配体质粒和所述的TALENs mRNA共转家蚕新鲜卵，孵化，饲养，化蛾，得G0代，使G0代自交，获得G1代，即雌性特异性表达绿色荧光蛋白和Cas9蛋白的家蚕品系W‑Cas9。