[发明专利]一种植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法及其应用

摘要

本发明涉及一种植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法，包括以下步骤：(1)菌株培养；(2)菌种保存；(3)提取菌株的基因组DNA提取；(4)菌株鉴定；(5)全基因组获得；(6)信号肽预测；(7)表达载体的构建；(8)质粒获得；(9)菌株诱导表达重组蛋白；(10)重组蛋白表达鉴定。本发明建立了有效的内源性信号肽预测方法，发现信号肽1320能够改善外源蛋白在植物乳杆菌中的表达状况，而且能够有效展示在细菌表面。通过本发明方法预测获得的1320信号肽以及制备获得的含有1320信号肽序列的表达载体，能够很好的植入到植物乳杆菌内，因此可用于植物乳杆菌载体疫苗开发和表面展示。

主权项

1.一种植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法，其特征在于，所述预测方法包括以下步骤：(1)菌株培养：将实验菌株涂布于固体MRS培养基中于37℃厌氧环境培养24h，挑取单克隆转接至MRS液体培养基中，继续培养，再次涂布于MRS固体培养基中；(2)菌种保存：挑取单克隆进行菌种保存；(3)提取菌株的基因组DNA；(4)菌株鉴定：利用PCR扩增对菌株基因组DNA进行鉴定；(5)全基因组获得：将经过步骤(4)鉴定的菌株基因组DNA进行测序获得该菌株的全基因组序列；(6)信号肽预测：对所述菌株的全基因组序列进行注释分析，将所述菌株编码的氨基酸序列输入SignalP 4.10在线预测软件预测获得若干可能的信号肽序列，并利用LAB‑Secreome数据库对这些信号肽进行预测分类，获得若干条待定信号肽序列；(7)表达载体的构建：构建含有待定信号肽序列的实验组表达载体和不含待定信号肽序列的对照组表达载体；(8)质粒获得：将实验组表达载体和对照组表达载体分别通过电转化导入至NZ3900感受态细胞内，筛选阳性克隆提取获得实验组质粒和对照组质粒；(9)菌株诱导表达重组蛋白：将实验组质粒和对照组质粒分别通过电转化导入至由实验菌株制备的感受态内，筛选阳性克隆后进行扩大培养，加入诱导剂继续培养诱导两组菌株表达重组蛋白；(10)重组蛋白表达鉴定：分别提取菌株内的重组蛋白，通过Western blot技术和间接免疫荧光技术验证导入实验组质粒的菌株的重组蛋白表达情况，能够表达重组蛋白的待定信号肽序列即为目标内源性信号肽。