[发明专利]一种表征等离子体诱导细胞内绝对钙离子浓度的方法

摘要

本发明是一种表征等离子体诱导细胞内绝对钙离子浓度的方法。本方法将制备的细胞悬浮液加入优化后的Fluo‑3 AM，添加0.8mM Pluronic F‑127，获得最大荧光强度Fmax值，或添加钙离子螯合剂EGTA，获得最小荧光强度Fmin值，制备的细胞悬浮液加入优化后的Fluo‑3 AM经大气压冷等离子体处理，结合多功能酶标仪测定F值，再根据公式计算出绝对钙离子浓度。本发明实现了荧光探针Fluo‑3 AM结合多功能酶标仪测定细胞绝对钙离子浓度的方法，该方法具有灵敏、高效、简便、精确测定和表征细胞内钙离子绝对浓度。

主权项

1.一种表征等离子体诱导细胞内绝对钙离子浓度的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1，制备细胞悬浮液；步骤2，优化fluo‑3AM使用条件(1)水浴温度和孵育时间优化将步骤1制备的细胞悬浮液加入fluo‑3AM，选取水浴温度30℃～44℃，孵育时间0min～120min处理，处理后的菌液进行细胞存活率分析选取最优；(2)探针fluo‑3AM终浓度和孵育时间优化将步骤1制备的细胞悬浮液加入fluo‑3AM，选取探针fluo‑3AM终浓度0～12μM，孵育时间0～215min处理，使用多功能酶标仪检测处理后细胞的荧光强度，并计算得到相对荧光强度，相对荧光强度最高的为最优；(3)探针装载顺序优化先等离子体处理—后装载探针和先装载探针—后等离子体处理，这两种顺序对细胞活性及细胞内钙离子浓度测定没有影响；步骤3，细胞质内绝对钙离子浓度测定步骤1制备的细胞悬浮液加入步骤2优化条件下的fluo‑3AM，添加0.8mM Pluronic F‑127，获得最大荧光强度Fmax值；或添加钙离子螯合剂EGTA，浓度范围为0～30nM，获得最小荧光强度Fmin值；步骤1制备的细胞悬浮液经大气压冷等离子体处理后加入步骤2优化条件下的fluo‑3AM或步骤1制备的细胞悬浮液先加入步骤3优化条件下的fluo‑3AM再经大气压冷等离子体处理，获得F值，根据公式(1)，已知Kd＝325nm为解离常数，计算即可得到细胞内绝对钙离子浓度；其中，Fmax值、Fmin值、F值均使用多功能酶标仪测定。