[发明专利]一种用紧穗野生稻成熟种子繁育再生植株的方法

摘要

本发明涉及一种用紧穗野生稻成熟种子繁育再生植株的方法，属植物组织培养技术领域。本发明方法包括：外植体的去除种皮处理，外植体灭菌，种子萌芽、愈伤组织诱导和增殖培养，愈伤组织分化培养，分化苗的生根培养、炼苗、移栽步骤。本发明运用不同植物激素组合和培养条件的组合，成功利用成熟种子诱导出紧穗野生稻愈伤组织，再将愈伤组织转移到增殖培养基上进行增殖培养，提高愈伤质量和数量。本发明的优点在于：大幅度提高了紧穗野生稻成熟种子的愈伤诱导率和再生植株，繁殖效率高、节约成本，克服了紧穗野生稻难以用种子繁殖的难题，促进了紧穗野生稻的保存、保护和利用。

主权项

1.一种用紧穗野生稻成熟种子繁育再生植株的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：a.外植体选择：收获的紧穗野生稻成熟种子，用纸袋装好，晒干，储存于干燥通风的地方；b.外植体处理：将晒干的成熟种子剥去谷壳，用购买的400目牛皮纸水砂纸将种皮磨掉，除干净种皮的种子用蒸馏水洗2遍，装在100mL的三角瓶中，用体积百分比为75％的酒精表面灭菌1分钟，无菌水洗3遍，再加入50mL体积百分比为0.1％的氯化汞和10ul体积百分比为20％的吐温灭菌处理20分钟，期间每5分钟摇动一次，倒掉氯化汞，再用体积百分比为75％的酒精表面灭菌1分钟，用无菌水洗3遍，将种子取出用无菌吸水纸吸干种子表面的水分；c.种子催芽：将b步骤处理后的种子放到铺有一层滤纸的培养皿中，加入20mL无菌水，用封口膜将培养皿封口，置于人工气候箱中28℃暗培养9天，期间每2天换一次水，待萌动芽长至0.2‑0.5cm时，用于愈伤组织诱导；d.愈伤组织诱导：将带芽的种子取出放入诱导培养基，置于人工气候箱28℃暗培养35天，芽的基部长出透明的带有粘液的愈伤组织，继续培养10‑16天，待愈伤长至直径0.2cm时进行愈伤继代培养；愈伤诱导培养基为：N6基本培养基+2,4‑D 5.0mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30％,PH6.0；e.愈伤组织继代：将带有粘液的愈伤组织从种子上分离下来，接入愈伤继代培养基中，置于人工气候箱中28℃暗培养，每20天继代一次，继代2‑3次后愈伤组织由白色变成淡黄色紧实颗粒；愈伤继代培养基为：N6基本培养基+2,4‑D 3.0‑4.0mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30％,PH6.0；f.愈伤组织增殖：挑选直径为0.2‑0.5cm的淡黄色紧实颗粒状愈伤组织，接入装有继代培养基的100ml三角瓶中，每瓶20个愈伤，置于温度为28℃、光照为2000lx的培养箱中进行弱光培养，每7天更换一次培养基，继代培养基同e步骤所述，21‑28天后，愈伤组织大量增值覆盖整个培养基表面，并呈现黄绿色；g.愈伤组织分化：将黄绿色紧实颗粒状的愈伤组织接入装有分化培养基Ⅰ的100ml三角瓶中，每瓶10‑15个，置于温度为28℃,光照为4000lx的培养箱中，10‑12天后，愈伤组织变为深绿色后，将深绿色的愈伤组织转入分化培养基Ⅱ中于温度为28℃,光照为4000lx的培养箱中继续培养20‑25天，愈伤分化出小苗，待小苗长至2‑3cm长时，转入壮苗培养基进行壮苗；分化培养基Ⅰ为：N6基本培养基+6‑BA 6mg/L+NAA 0.5mg/L+KT 2mg/L+ZT 2mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30％，PH6.0；分化培养基Ⅱ为：N6基本培养基+6‑BA 4mg/L+NAA 0.3mg/L+KT 2mg/L+ZT 2mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30％，PH6.0；h.壮苗培养：将2‑3cm长的小苗从培养瓶中取出接入壮苗培养基中，置于28℃，4000lx的光照培养箱中培养20‑27天，小苗茎干增粗并长至4‑5cm高时，进行生根培养；壮苗培养基为：N6基本培养基+6‑BA 2mg/L+IAA 0.3mg/L+TDZ 2mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30％，PH6.0；I.生根培养：将4‑5cm高的健壮无根苗接入装有生根培养基的直径5cm、长20cm的试管中，没根试管2‑3株，置于28℃，2000lx的光照培养箱中进行生根培养，每10天更换一次培养基，20‑25天后，根长至5‑7cm，苗长至10‑12cm后进行炼苗；生根培养基为：N6基本培养基+IAA 0.3mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30％，PH6.0；J.炼苗：将苗从试管中取出，用28℃自来水将苗根部的培养基冲洗干净，放入直径5cm、长20cm的试管中，加水淹没根部，管口敞开，置于28℃，2000lx的光照培养箱中，5天后，将苗从光照培养箱中移出，栽到购于市场的营养基质中，置于温室进行常规培养，直至叶片展开、新根长出，移入较大的花盆中，常规培养直至种子成熟。